《2017-2018學(xué)年高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第10課時(shí) 分子生物學(xué)技術(shù)同步備課教學(xué)案 蘇教版選修1》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2017-2018學(xué)年高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第10課時(shí) 分子生物學(xué)技術(shù)同步備課教學(xué)案 蘇教版選修1（15頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 第10課時(shí)　分子生物學(xué)技術(shù) [學(xué)習(xí)導(dǎo)航]　1.結(jié)合教材了解PCR技術(shù)的基本操作。2.理解PCR擴(kuò)增DNA片段的原理。 3.結(jié)合教材，嘗試進(jìn)行目的DNA片段的體外擴(kuò)增。 [重難點(diǎn)擊]　1.了解PCR技術(shù)的基本操作。2.理解PCR的原理。 一、使用PCR儀的安全措施和PCR反應(yīng)程序 1.DNA分子的結(jié)構(gòu) (1)寫出各個(gè)標(biāo)號(hào)的名稱：①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鳥嘌呤；④胸腺嘧啶；⑤脫氧核糖；⑥磷酸基團(tuán)；⑦胸腺嘧啶脫氧核苷酸；⑧氫鍵；⑨堿基對(duì)；⑩一條脫氧核苷酸鏈。 (2)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確表示DNA鏈的方向，通常將DNA的羥基末端稱為3′端，將磷酸基團(tuán)的末端稱為5

2、′端，按此原則在圖上方框內(nèi)標(biāo)出兩條鏈的方向。 答案　左鏈上5′端，下3′端；右鏈上3′端，下5′端。 2.細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 打開DNA雙螺旋 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3′端起點(diǎn) 3.PCR技術(shù) (1)概念：在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的技術(shù)稱為PCR技術(shù)。 (2)物質(zhì)條件：DNA模板、四種脫氧核苷酸、TaqDNA

3、聚合酶、引物。 (3)PCR反應(yīng)的過(guò)程及結(jié)果 ①PCR反應(yīng)程序 a.變性：在94 ℃高溫下，作為模板的雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA。 b.退火(復(fù)性)：反應(yīng)體系的溫度降至55 ℃，引物與作為模板的單鏈DNA上的特定部位相互配對(duì)。 c.延伸：反應(yīng)體系的溫度回升到72 ℃左右，按照單鏈DNA上的脫氧核苷酸序列，4種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在TaqDNA聚合酶的作用下連接到引物之后，使引物鏈延伸，形成互補(bǔ)的DNA雙鏈。 ②結(jié)果 a.PCR擴(kuò)增一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、退火、延伸三步。 b.兩引物之間的固定長(zhǎng)度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 1.PCR原理

4、PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同？請(qǐng)分析原因。 答案　不相同。體內(nèi)DNA復(fù)制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反應(yīng)時(shí)所用引物一般是人工加入的一小段單鏈DNA。 2.PCR反應(yīng)過(guò)程 (1)PCR反應(yīng)中需要解旋酶和DNA聚合酶嗎？若需要，則與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制有何區(qū)別？ 答案　PCR反應(yīng)不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反應(yīng)中需要高溫使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高溫。 (2)PCR的每次循環(huán)中應(yīng)如何控制溫度？請(qǐng)分析原因。 答案　每次循環(huán)中先高溫解旋，再低溫使引物與模板結(jié)合，最后適當(dāng)升溫有利于Taq DNA聚合酶發(fā)揮作用。

5、(3)結(jié)合下圖分析PCR過(guò)程中DNA復(fù)制的方向是怎樣的？ 答案　DNA的羥基(—OH)末端為3′端；磷酸基團(tuán)的末端為5′端。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 歸納總結(jié)　PCR擴(kuò)增與DNA復(fù)制的異同 項(xiàng)目 DNA復(fù)制 PCR擴(kuò)增 不 同 點(diǎn) 時(shí)期 有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂的間期 任何時(shí)期 場(chǎng)所 活細(xì)胞內(nèi) 細(xì)胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的Taq DNA聚合酶 引物 有轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生RNA作引物，無(wú)需人工加入 無(wú)轉(zhuǎn)錄，無(wú)引物產(chǎn)生，需人工加

6、入兩種DNA引物 特點(diǎn) 邊解旋邊復(fù)制 先全部解旋后開始復(fù)制 緩沖液 不需緩沖液 配制緩沖液代替細(xì)胞核液 設(shè)備 無(wú) 控制溫度變化的溫控設(shè)備 相 同 點(diǎn) 原理 嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 引物 都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 模板 DNA的兩條鏈為模板 特點(diǎn) 半保留復(fù)制 原料 游離的四種脫氧核苷酸 1.下列關(guān)于DNA復(fù)制和PCR技術(shù)的描述中，正確的是(　　) A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5′端延伸DNA鏈 B.DNA復(fù)制不需要引物 C.引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合 D.PCR擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列

7、答案　C 解析　DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，故DNA復(fù)制需要引物。DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，而不能從5′端延伸DNA鏈。引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與DNA母鏈相結(jié)合。PCR擴(kuò)增的對(duì)象是DNA，不是氨基酸序列。 2.PCR技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低難以對(duì)樣品進(jìn)行研究的問(wèn)題，而被廣泛應(yīng)用，與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR可以快速擴(kuò)增所需的DNA片段，請(qǐng)分析回答下列有關(guān)問(wèn)題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù)中的解旋原理是

8、 。 (2)此過(guò)程需要一種Taq DNA聚合酶。該酶是從 中分離的。 (3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。 (4)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在 中才能進(jìn)行，并且要嚴(yán)格控制 條件。 (5)PCR中加入的引物有 種，加入引物的作用是 。 答

9、案　(1)DNA的熱變性原理　(2)水生耐熱細(xì)菌Taq　(3)耐高溫　(4)一定的緩沖溶液　溫度　(5)2　作為DNA復(fù)制的起點(diǎn) 解析　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋，其原理是DNA的熱變性原理。(2)Taq DNA聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌Taq中提取的。(3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的環(huán)境中不變性，具有耐高溫的特性。(4)PCR反應(yīng)需要適宜的溫度和pH，因此PCR反應(yīng)要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，并需嚴(yán)格控制好溫度條件。(5)PCR需要兩種引物，引物的識(shí)別位點(diǎn)決定了PCR擴(kuò)增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段單鏈DNA，作用

10、是引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點(diǎn)。 一題多變 細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制需要適宜的溫度和pH嗎？若需要，是如何實(shí)現(xiàn)的？ 答案　需要。細(xì)胞內(nèi)的適宜溫度和pH與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，低等生物與環(huán)境因素有關(guān)。 易錯(cuò)提醒　與PCR原理有關(guān)的三個(gè)易錯(cuò)點(diǎn) (1)酶的作用位點(diǎn)：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開；DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認(rèn)為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。 (2)DNA聚合酶和DNA連接酶：DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸連接到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，

11、不需要模板。 (3)PCR中的解旋過(guò)程：PCR過(guò)程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時(shí)的溫度不會(huì)破壞磷酸二酯鍵，因此，DNA加熱變性后變?yōu)閱捂湥⑽捶纸獬蓡误w。 二、目的DNA片段的體外擴(kuò)增與鑒定 1.DNA片段的PCR擴(kuò)增 (1)準(zhǔn)備器材：PCR儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、0.2 mL PCR微量離心管、自動(dòng)取液器、模板DNA等。 (2)在0.2 mL PCR微量離心管中加入5 μL 10倍濃縮的PCR緩沖液，4種脫氧核苷酸的溶液各5 μL,1 μL模板DNA,5 μL引物1和5 μL引物2,29 μL雙蒸水。 (3)煮沸5 min之后冰浴2 min，低速離心，按照1單位

12、/μL加入TaqDNA聚合酶。 (4)擴(kuò)增DNA片段的反應(yīng)程序：將微量離心管放入PCR儀中，蓋上樣品池蓋。在94 ℃的條件下預(yù)熱5 min，再設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，30 s→55 ℃，30 s→72 ℃，1 min(以上過(guò)程循環(huán)30次)。最后一次延伸條件為72 ℃，1 min。 (5)按照PCR儀器操作要求運(yùn)行反應(yīng)程序。 2.DNA分子的測(cè)定 (1)配制二苯胺試劑：分別配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加入1.5 mL濃硫酸，用棕色瓶保存)和B液(體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙醛溶液)。將0.1 mL B液加入10 mL A液中，混勻。 (2)條件：取一定量擴(kuò)增前和

13、擴(kuò)增后的溶液分別放入等量的二苯胺試劑，混勻后觀察顏色變化。用沸水浴加熱上述溶液。 (3)現(xiàn)象：出現(xiàn)藍(lán)色現(xiàn)象。 3.定量分析方法：如果需要進(jìn)行定量分析，可以采用紫外分光光度法或瓊脂糖凝膠電泳法。前者需要使用紫外分光光度計(jì)，后者需要使用電泳儀等。 1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程分析 (1)離心的目的是什么？在離心的過(guò)程中，微量離心管的蓋子為什么一定要蓋嚴(yán)？ 答案　離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效率。微量離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢。 (2)在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁，目的是什么？ 答案　離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應(yīng)液混合均勻。 (3)PCR實(shí)驗(yàn)中

14、使用的微量離心管、取液器、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，為什么這樣操作？還有哪些操作與此目的相同？ 答案　為避免外源DNA等的污染。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，取液器上的槍頭都必須更換。 2.結(jié)果檢測(cè) (1)實(shí)驗(yàn)中為什么要測(cè)定DNA的含量？ 答案　實(shí)際操作過(guò)程中會(huì)有許多因素影響DNA含量，所以需要對(duì)DNA含量進(jìn)行測(cè)定。 (2)如何判斷DNA擴(kuò)增成功？ 答案　①可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。②電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。 (3)PCR擴(kuò)增過(guò)程可能會(huì)出現(xiàn)哪些異常結(jié)果？ 答案　樣品

15、產(chǎn)物少，或產(chǎn)生新的DNA。 3.進(jìn)行PCR反應(yīng)的具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為(　　) ①設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序?、诎磁浞綔?zhǔn)備好各組分?、塾梦⒘恳埔浩飨蛭⒘侩x心管中依次加入各組分　④進(jìn)行PCR反應(yīng)?、蓦x心使反應(yīng)液集中在離心管底部 A.②③⑤④① B.①⑤③②④ C.②③⑤①④ D.④②⑤③① 答案　C 解析　PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備(包括配制配方及將各配方放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上)―→移液―→混合―→離心―→反應(yīng)。PCR儀是一種自動(dòng)控制溫度的儀器，設(shè)計(jì)好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了。 4.近20年來(lái)，PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段，其原理是利用D

16、NA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在短時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，從而使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈間的 鍵完全打開，稱為 ；而在細(xì)胞中是在 酶的作用下進(jìn)行的。 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個(gè)特定區(qū)段，應(yīng)該加入 種特定的引物。當(dāng)溫度降低至55 ℃時(shí)，引物與兩條“舒展”的模板鏈的特定位置結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是

17、 。 (3)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個(gè)條件，即液體環(huán)境、適宜的 和 ，前者由 自動(dòng)調(diào)控，后者則靠 來(lái)維持。 (4)通過(guò)PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，如果將一個(gè)用15N標(biāo)記的DNA分子放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是 。 問(wèn)題導(dǎo)析　(1)解旋是使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，PCR技術(shù)是利用DNA的熱

18、變性原理，細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不論復(fù)制幾次，含有15N標(biāo)記的DNA分子都只有2個(gè)。 答案　(1)氫　解旋　解旋　(2)兩　3′　從子鏈的5′端向3′端延伸　(3)溫度　酸堿度　PCR儀　緩沖液　(4)1/8 解析　(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為解旋，而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個(gè)基本反應(yīng)步驟：變性(94 ℃)、退火(55 ℃)、延伸(72 ℃)，其特異性依賴于與靶序列互補(bǔ)的引物，引物是兩段與待擴(kuò)增DNA序列互補(bǔ)的片段，兩引物之間的距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從

19、引物的3′端延伸DNA鏈，則DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(3)PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖溶液)，每一個(gè)步驟都需要適宜的溫度和酸堿度等。(4)一個(gè)DNA分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成16個(gè)DNA分子，15N標(biāo)記的DNA分子有2個(gè)，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。 1.PCR利用了DNA的哪種特性來(lái)控制DNA的解聚與結(jié)合(　　) A.特異性 B.穩(wěn)定性 C.熱變性 D.多樣性 答案　C 2.符合PCR反應(yīng)條件的一項(xiàng)是(　　) ①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境?、贒

20、NA模板　③合成引物?、芩姆N脫氧核苷酸?、軩NA聚合酶?、轉(zhuǎn)NA解旋酶　⑦限制酶?、鄿乜卦O(shè)備 A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧ C.③④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑤⑧ 答案　D 解析　PCR反應(yīng)模擬了生物細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，只是無(wú)需解旋酶(可熱變性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。 3.下列關(guān)于PCR的描述中，正確的是(　　) ①PCR是一種酶促反應(yīng)?、谝餂Q定了擴(kuò)增的特異性?、蹟U(kuò)增DNA利用了熱變性的原理　④擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列 A.①②④ B.②③④ C.①③④ D.①②③ 答案　D 解析　PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，在高溫條

21、件下，把DNA的雙鏈打開，緩慢冷卻后，又重新結(jié)合，需要耐高溫的DNA聚合酶，同時(shí)，還需要引物，從引物的3′端連接脫氧核苷酸。 4.如圖所示為PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，請(qǐng)分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A.第一次循環(huán) B.第二次循環(huán) C.第三次循環(huán) D.第四次循環(huán) 答案　A 解析　在PCR反應(yīng)中，以引物為標(biāo)記，第一次循環(huán)時(shí)，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng)，所以會(huì)形成DNA分子兩端均含引物的情況，如下圖所示，因此題干中所出現(xiàn)的

22、情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。 5.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔ? 的末端稱為5′端，當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的 開始延伸DNA鏈。 (2)PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問(wèn)題，但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問(wèn)題。到20世紀(jì)80年代，科學(xué)家從一種Taq細(xì)菌中分離到 ，它的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了上述問(wèn)題。要將Taq細(xì)菌從其他普通的微生物中分離出來(lái)，所用的培養(yǎng)基叫

23、 。 (3)PCR的每次循環(huán)可以分為 三步。假設(shè)在PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在5次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有 個(gè)這樣的DNA片段。 (4)簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的主要應(yīng)用： (要求至少答兩項(xiàng))。 答案　(1)磷酸基團(tuán)　3′端　(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶　選擇培養(yǎng)基　(3)變性、退火和延伸　32　(4)遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等 解析　一條脫氧核苷酸鏈一端是游離的羥基，另一端是游離的磷酸基團(tuán)，含羥基的一端是3′端，含磷酸基團(tuán)的是

24、5′端。引物的5′端與模板鏈的3′端結(jié)合，然后沿著引物的3′端延伸。耐高溫的Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是實(shí)現(xiàn)PCR的關(guān)鍵，該酶可以利用選擇培養(yǎng)基從一些微生物中分離出來(lái)。PCR一次循環(huán)要經(jīng)歷變性、退火和延伸三個(gè)階段。 課時(shí)作業(yè) [學(xué)考達(dá)標(biāo)] 1.PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA，需要的條件是(　　) ①目的基因?、谝铩、鬯姆N脫氧核苷酸?、蹹NA聚合酶等?、輒RNA　⑥核糖體 A.②③④⑤ B.①②③⑥ C.①②③④ D.①③④⑤ 答案　C 解析　PCR技術(shù)需要目的基因作為擴(kuò)增的模板，DNA聚合酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，而引物是滿足DNA聚合酶起作用的需要，四種脫氧核苷酸是該過(guò)程的原料，以

25、及一定的緩沖溶液和能嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。 2.下列有關(guān)PCR反應(yīng)的敘述，正確的是(　　) A.PCR反應(yīng)所需要的引物只是RNA B.PCR反應(yīng)所需要的材料是核糖核苷酸 C.PCR反應(yīng)所需要的酶在60 ℃會(huì)變性 D.PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行 答案　D 解析　PCR反應(yīng)需要的引物一般是DNA，反應(yīng)所需要的材料是脫氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高溫的，在60 ℃不會(huì)變性。 3.下列各項(xiàng)屬于引物作用的是(　　) A.打開DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始復(fù)制 D.提供模板 答案　C 解析　DNA分子的復(fù)制具有方向

26、性，即只能從子鏈的5′端→3′端方向進(jìn)行復(fù)制。當(dāng)引物與DNA母鏈結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。 4.PCR一般要經(jīng)過(guò)三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時(shí)(　　) A.仍與引物Ⅰ結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸 B.與引物Ⅱ結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸 C.同時(shí)與引物Ⅰ和引物Ⅱ結(jié)合進(jìn)行子鏈的延伸 D.無(wú)需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈 答案　B 解析　當(dāng)由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時(shí)，此單鏈引物固定端為5′端，因此與它互補(bǔ)的子鏈應(yīng)從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結(jié)合延伸DNA子鏈。 5.PC

27、R儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) ①94 ℃，使DNA分子變性，磷酸二酯鍵斷開?、?4 ℃，使DNA分子變性，解開螺旋　③55 ℃時(shí)，使DNA分子開始復(fù)制、延伸　④55 ℃時(shí)，引物與DNA單鏈結(jié)合?、?2 ℃時(shí)，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 A.①③⑤ B.②③⑤ C.②④⑤ D.②④⑥ 答案　C 解析　PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。當(dāng)溫度上升至94 ℃時(shí)，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到55

28、 ℃時(shí)，引物與DNA單鏈結(jié)合，恢復(fù)活性；溫度上升至72 ℃時(shí)，DNA分子開始復(fù)制、延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。 6.下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中，不正確的是(　　) A.在PCR的變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，DNA在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)可利用解旋酶實(shí)現(xiàn) B.退火過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的 C.延伸過(guò)程中需要耐高溫的DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D.PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高 答案　C 解析　變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開，DNA在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)借助解旋酶來(lái)實(shí)現(xiàn)；根據(jù)堿基

29、互補(bǔ)配對(duì)原則，引物可與 DNA模板鏈結(jié)合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四種脫氧核苷酸為原料；PCR過(guò)程所需溫度較高，會(huì)導(dǎo)致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫的DNA聚合酶。 [高考提能] 7.有關(guān)下列操作過(guò)程的敘述，錯(cuò)誤的是(　　) A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、取液器、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲(chǔ)存 C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，取液器上的槍頭都必須更換 答案　C 解析　在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱中取出后應(yīng)放在冰塊上

30、緩慢融化，而不能迅速融化，即C項(xiàng)錯(cuò)誤。 8.“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下可以繼續(xù)鏈的延伸)，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如下圖乙所示，其中第⑤種DNA分子有幾個(gè)(　　) A.8 B.6 C.4 D.2 答案　A 解析　由圖分析可知：X基因第一次復(fù)制得到兩個(gè)兩種DNA分子：①和②；X基因第二次復(fù)制得到四個(gè)四種DNA分子：①?gòu)?fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④；X基因第三次復(fù)制得到八個(gè)五種D

31、NA分子：①?gòu)?fù)制得①和③、③復(fù)制得③和⑤、②復(fù)制得②和④、④復(fù)制得④和⑤；X基因第四次復(fù)制得到16個(gè)五種DNA分子：①?gòu)?fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④、兩個(gè)③復(fù)制得兩個(gè)③和兩個(gè)⑤、兩個(gè)④復(fù)制得兩個(gè)④和兩個(gè)⑤、兩個(gè)⑤得到4個(gè)⑤。從上面的推測(cè)可知，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中有8個(gè)⑤。 9.在PCR擴(kuò)增DNA的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)一個(gè)DNA分子經(jīng)過(guò)30次循環(huán)后，應(yīng)該得到230個(gè)DNA分子，但是結(jié)果只有約210個(gè)DNA分子，那么出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因不可能是(　　) A.Taq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制 B.系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥 C.循環(huán)次數(shù)不夠 D.引物不能與母鏈結(jié)合 答案　D 解析　如果Taq DNA聚合

32、酶活力不夠，或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少，A項(xiàng)正確；如果PCR系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥，則達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果，B項(xiàng)正確；如果循環(huán)次數(shù)過(guò)少，產(chǎn)物的量比預(yù)期的少，C項(xiàng)正確；如果引物設(shè)計(jì)不合理，若不能與模板DNA結(jié)合，將造成無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增，而結(jié)果得到了210個(gè)DNA分子，D項(xiàng)錯(cuò)誤。 10.有關(guān)PCR技術(shù)的說(shuō)法，下列敘述不正確的是(　　) A.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù) B.在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似 C.PCR反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D.PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為

33、變性、退火和延伸 答案　C 解析　PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文縮寫，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、退火和延伸三步。 11.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，下圖表示合成過(guò)程，請(qǐng)據(jù)圖分析回答下面的問(wèn)題。 (1)A過(guò)程高溫使DNA變性解旋，對(duì)該過(guò)程的原理敘述正確的是 。 A.該過(guò)程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B.該過(guò)程用到限制酶破壞磷酸二酯鍵 C.該

34、過(guò)程不需要解旋酶的作用 D.該過(guò)程與人體細(xì)胞的過(guò)程完全相同 (2)C過(guò)程要用到的酶是耐高溫的 。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)可以 加入， (填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反應(yīng)除提供酶外，還需要滿足的基本條件有： 。 (3)如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不做標(biāo)記，控制“94 ℃－55 ℃－72 ℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占 。 答案　(1

35、)C (2)DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸，通過(guò)控制溫度和酸堿度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行 (3)25% 解析　(1)高溫所起的作用類似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂湣?2)C過(guò)程是PCR技術(shù)的延伸階段，當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。這種DNA聚合酶在高溫下不變性，所以一次性加入即可。(3)PCR技術(shù)遵循半保留復(fù)制的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)三次循環(huán)，共產(chǎn)生8個(gè)DNA分子，其中有2個(gè)DNA分子含有15N標(biāo)記。 12.PCR是一種體外快速擴(kuò)增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因

36、片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)。PCR需要模板DNA、引物、脫氧核苷酸和DNA聚合酶等條件。如圖為模板DNA分子及2種引物，請(qǐng)據(jù)圖回答相關(guān)問(wèn)題： (1)PCR的全稱是 。PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR技術(shù)中先用94 ℃高溫處理的目的是 ，而這一過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò) 實(shí)現(xiàn)的。 (2)在PCR技術(shù)中所需要的引物通常為一段單鏈DNA。請(qǐng)?jiān)趫D中繪出引物結(jié)合的位置。 (3)若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入 個(gè)引物。 (4)DNA子鏈復(fù)制的

37、方向是 ，這是由于 。 答案　(1)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)　使DNA變性(使DNA的兩條鏈解開)　解旋酶的催化 (2)如圖所示 (3)211－2 (4)從5′端到3′端　DNA聚合酶只能從引物的3′端開始連接單個(gè)脫氧核苷酸分子 解析　PCR技術(shù)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在PCR技術(shù)中，用94 ℃高溫處理的目的是使DNA分子中的氫鍵斷裂，使兩條鏈解開，即使DNA分子變性。引物通常是一種單鏈DNA，它能與解開的DNA母鏈的3′端結(jié)合，為DNA聚合酶提供吸附位點(diǎn)，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，從而決定了D

38、NA子鏈復(fù)制的方向是從5′端到3′端。在DNA分子擴(kuò)增時(shí)，需要2種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復(fù)制的起點(diǎn)，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，即2×210－2＝211－2 (個(gè))。 13.PCR技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行研究的問(wèn)題，而被廣泛應(yīng)用，此過(guò)程需要一種Taq DNA聚合酶。 請(qǐng)回答有關(guān)問(wèn)題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù) 來(lái)實(shí)現(xiàn)。 (2)Taq DNA聚合酶是從熱泉中的Taq細(xì)菌中分離出來(lái)的。 ①為什么Taq細(xì)菌能從熱泉中被篩選出來(lái)呢？

39、 。 ②Taq DNA聚合酶的功能是 。 (3)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在 中才能進(jìn)行，并且要嚴(yán)格控制 條件。 (4)PCR反應(yīng)中加入的引物有 種，加入引物的作用是 。 答案　(1)通過(guò)高溫使DNA分子發(fā)生解旋 (2)①熱泉70～80 ℃的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物?、诖呋撗鹾塑账嶂g形成磷酸二酯鍵 (3)一

40、定的緩沖溶液　溫度 (4)2　作為DNA復(fù)制的起點(diǎn) 解析　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋。(2)①利用Taq細(xì)菌特有的特性與其他細(xì)菌區(qū)分開來(lái)，Taq細(xì)菌具有耐高溫的特性，放在高溫環(huán)境下，其他絕大多數(shù)細(xì)菌死亡，而Taq細(xì)菌得以保留。②在DNA分子復(fù)制中，Taq DNA聚合酶將一個(gè)脫氧核苷酸的脫氧核糖和另一個(gè)脫氧核苷酸的磷酸連接形成磷酸二酯鍵。(3)PCR反應(yīng)是在一定的緩沖溶液中進(jìn)行的，并需嚴(yán)格控制好溫度條件。(4)PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程中的原料是完全相同的，并加入2種引物，引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點(diǎn)。

41、 [真題體驗(yàn)] 14.(2013·江蘇，22)小鼠雜交瘤細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體用于人體試驗(yàn)時(shí)易引起過(guò)敏反應(yīng)，為了克服這個(gè)缺陷，可選擇性擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達(dá)。下列相關(guān)敘述正確的是(多選)(　　) A.設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)不必考慮表達(dá)載體的序列 B.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列 C.PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶 D.一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細(xì)胞 答案　BD 解析　設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)，要考慮擴(kuò)增的目的基因與載體兩端序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，A錯(cuò)誤；DNA復(fù)制沿著模板進(jìn)行，不必知道基因的全部序列，

42、B正確；PCR技術(shù)中的DNA聚合酶是耐高溫的DNA聚合酶，不是從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶，C錯(cuò)誤；目的基因編碼產(chǎn)物不同，相應(yīng)的受體細(xì)胞不同，D正確。 15.(2011·江蘇，33節(jié)選)請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如圖所示)。 圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。 ①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為 。 ②在第 輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。 (2)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理(

43、如圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。 ①第1組： ； ②第2組： 。 (3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)? 。 答案　(1)①15/16?、谌? (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 ②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 (3)DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 解析　(1)①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。(2)某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。 15