《2019-2020學(xué)年高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第二節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)案 蘇教版選修1》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2019-2020學(xué)年高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第二節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)案 蘇教版選修1（17頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第二節(jié)　分子生物學(xué)技術(shù) 學(xué)習(xí)導(dǎo)航 明目標(biāo)、知重點(diǎn)難點(diǎn) 嘗試PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的基本操作。(重、難點(diǎn)) 體驗(yàn)PCR這一常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。(難點(diǎn)) 理解PCR的原理，討論P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用。(重點(diǎn)) [學(xué)生用書P56]) 一、閱讀教材P83分析使用PCR儀的安全措施 1．嚴(yán)禁在PCR儀運(yùn)行過程中打開池蓋，否則會造成儀器的永久損壞。 2．儀器運(yùn)行時，樣品池及池蓋內(nèi)表面溫度較高，當(dāng)心灼傷。 3．儀器運(yùn)行時，加熱器內(nèi)腔為高溫、高壓環(huán)境，嚴(yán)禁觸及。 4．儀器運(yùn)行過程中如果發(fā)出尖銳的刺刮聲音，請立刻停止運(yùn)行，檢查是否有微量離心管斷裂等故障。 5．儀器運(yùn)行過程中

2、如果沒有反應(yīng)，請切斷電源，進(jìn)行檢查。 6．必須保持樣品池內(nèi)部的清潔，可用蘸有體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精棉簽擦拭相關(guān)部位。 7．儀器必須放置在PCR實(shí)驗(yàn)室里，操作者在操作的時候必須遵循PCR實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)規(guī)定，做好穿防護(hù)服、戴防護(hù)手套等相關(guān)防護(hù)措施。 8．當(dāng)儀器接通電源后，打開外殼或移走部件可能會造成人員傷害，因此，在進(jìn)行任何調(diào)整、替換、保養(yǎng)或維修之前，請切斷所有的電源。 二、閱讀教材P84完成多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序 1．物質(zhì)準(zhǔn)備：向離心管中加入模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。 2．變性：在 94 ℃高溫下，作為模板的雙鏈DNA解旋為單鏈DNA。 3．退火(復(fù)性)：反

3、應(yīng)體系的溫度降至 55 ℃，引物與單鏈DNA上的特定部位相互配對。 4．延伸：反應(yīng)體系的溫度回升到 72 ℃左右，按照單鏈DNA上的脫氧核苷酸序列，4種脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對原則，在TaqDNA聚合酶的作用下連接到引物之后，使引物鏈延伸，形成互補(bǔ)的DNA雙鏈。 三、閱讀P85～87分析目的DNA片段的體外擴(kuò)增與鑒定 1．DNA片段的PCR擴(kuò)增 (1)準(zhǔn)備器材：PCR儀、臺式高速離心機(jī)、0.2 mL PCR微量離心管等。 (2)在0.2 mL PCR微量離心管中加入 5_μL_10倍濃縮的PCR緩沖液，4種脫氧核苷酸的溶液各5 μL，1_μL模板DNA，5_μL引物1和5 μL引物

4、2，29_μL雙蒸水。 (3)煮沸 5_min之后冰浴 2_min，低速離心，按照1單位/μL加入TaqDNA聚合酶。 (4)擴(kuò)增DNA片斷的反應(yīng)程序：將微量離心管放入PCR儀中，蓋上樣品池蓋。在 94_℃的條件下預(yù)熱5 min，再設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?4_℃，30_s→55_℃，30_s→72_℃，1_min(以上過程循環(huán)30次)。最后一次延伸條件為 72_℃，1_min。 (5)按照PCR儀器操作要求運(yùn)行反應(yīng)程序。 2．DNA分子的測定 (1)配制二苯胺試劑：分別配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加入1.5 mL濃硫酸，用棕色瓶保存)和B液(體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙

5、醛溶液)。將0.1 mL B液加入10 mL A液中，混勻。 (2)條件：在沸水浴中加熱。 (3)現(xiàn)象：出現(xiàn)藍(lán)色現(xiàn)象。 判一判 (1)DNA擴(kuò)增的變性過程中需要DNA解旋酶的參與。(×) (2)DNA擴(kuò)增退火過程中需要DNA聚合酶的參與。(×) (3)DNA延伸過程需要TaqDNA聚合酶的作用。(√) (4)所有PCR中使用的引物都是相同的。(×) 連一連 　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[學(xué)生用書P57] 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)又叫PCR技術(shù)。通過PCR技術(shù)就可以在體外對DNA的特定片段進(jìn)行快速的復(fù)制，并獲得大量的目的基因。結(jié)合教材P84內(nèi)容完成以下探究。 探究1

6、　結(jié)合圖示理解PCR反應(yīng)的過程及結(jié)果 (1)PCR反應(yīng)過程 ①變性：當(dāng)溫度上升到94 ℃左右時，雙鏈DNA解旋為單鏈(如圖)。 ②退火：系統(tǒng)溫度下降至55 ℃時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合(如下圖)。 ③延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、G、C)在TaqDNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈(如圖)。 (2)結(jié)果 ①PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、退火、延伸三步。 ②兩引物之間的固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 探究2　結(jié)合教材，推算PCR擴(kuò)增數(shù)目的理論值 理論上DNA擴(kuò)增

7、呈指數(shù)增長，若只有一個DNA模板，則復(fù)制n次后有 2n個DNA；若一開始有m個DNA模板，則復(fù)制n次后有m×2n個DNA。 　討論解旋酶、DNA聚合酶與DNA連接酶的作用？ 提示：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開，而DNA聚合酶與DNA連接酶都可催化形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶是將單個核苷酸加到已有的單鏈片段的3′羥基上，需要模板，而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。 PCR體外擴(kuò)增DNA與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較 體內(nèi)復(fù)制 PCR反應(yīng) 不 同 點(diǎn) 解旋 在解旋酶的作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開 加熱至 94 ℃左右，雙鏈全部

8、解開 合成子鏈 一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成 分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度在 72 ℃左右 特點(diǎn) 邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制 體外迅速擴(kuò)增 DNA 聚合酶 需要 需要TaqDNA聚合酶 循環(huán) 次數(shù) 受生物體自身控制 30次 溫度 體內(nèi)溫和條件 高溫(可變) 產(chǎn)物 完整DNA DNA片段 相同點(diǎn) ①需提供DNA復(fù)制的模板； ②以四種脫氧核苷酸為原料； ③都需要一定的緩沖溶液 突破1　PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制 過程區(qū)別 1．如圖表示細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴(kuò)增兩個過程，兩反應(yīng)過程的條件中相同的是

9、(　　) A．模板　　　　　　　 B．原料 C．酶 D．能量供應(yīng) 解析：選B。選項(xiàng)A模板不同，胞內(nèi)DNA復(fù)制以整個DNA分子作為模板，PCR擴(kuò)增卻以一段目的DNA作為模板。選項(xiàng)B原料相同，均以4種脫氧核苷酸為原料。選項(xiàng)C酶不相同，胞內(nèi)DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR擴(kuò)增通過高溫解旋而不需要解旋酶，延伸只需熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶。選項(xiàng)D能量供應(yīng)不同，胞內(nèi)DNA復(fù)制過程由ATP提供能量，而PCR擴(kuò)增主要由外界供能。 突破2　PCR擴(kuò)增的過程 2．近20年來，PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制

10、，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在短時間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。據(jù)此回答下列問題： (1)加熱使DNA雙鏈間的________鍵完全打開，稱為________；而在細(xì)胞中是在________酶的作用下進(jìn)行的。 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個特定區(qū)段，應(yīng)該加入________種特定的引物。 (3)通過PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，如果將一個用15N標(biāo)記的DNA分子放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是________。 解

11、析：(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個基本反應(yīng)步驟：變性(94 ℃左右)、退火(40～60 ℃)、延伸(72 ℃左右)，其特異性依賴于與靶序列互補(bǔ)的引物，引物是兩段與待擴(kuò)增DNA序列互補(bǔ)的片段，兩引物之間的距離決定擴(kuò)增片段 的長度。(3)一個DNA分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成16個DNA分子，15N標(biāo)記的DNA分子有2個，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。 答案：(1)氫　變性　解旋 (2)兩　 (3)1/8 PCR擴(kuò)增原理的有關(guān)拓展 (1)DNA熱變性：雙鏈DN

12、A變性DNA。 (2)理論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長，實(shí)驗(yàn)值要略小于理論值。實(shí)際操作過程中，由于無關(guān)變量的影響，一般來說，實(shí)驗(yàn)值要略小于理論值。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物 Ⅱ 結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段序列呈指數(shù)擴(kuò)增。　 　目的DNA片段的體外擴(kuò)增與測定[學(xué)生用書P58] 目的DNA片段的PCR擴(kuò)增是在PCR儀中進(jìn)行。結(jié)合教材P85～87內(nèi)容完成以下探究。 探究1　完善下列步驟，學(xué)會目的DNA片段 的體外擴(kuò)增的操作過程 探究2　觀察下圖示意

13、圖，理解DNA復(fù)制 過程 由此可見，在PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶從引物的 3′端開始延伸DNA鏈，所以DNA的合成方向總是從子鏈的 5′端向 3′端延伸。 探究3　結(jié)合教材，完成DNA分子的測定 (1)配制二苯胺試劑：分別配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加入1.5 mL濃硫酸，用棕色瓶保存)和B液(體積分?jǐn)?shù)為0.2 %的乙醛溶液)。將0.1 mL B液加入10 mL A液中，混勻。 (2)取一定量的擴(kuò)增前和擴(kuò)增后的溶液分別放入兩支試管中，加入等量的二苯胺試劑，混勻后觀察溶液的顏色。用沸水浴加熱上述溶液。在加熱過程中，隨時注意試管中溶液顏色的變化。 (3)

14、根據(jù)藍(lán)色的深淺，可以粗略地比較擴(kuò)增前和擴(kuò)增后溶液中DNA的含量是否有變化。 　(1)試概括PCR技術(shù)原理。 提示：在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似。PCR技術(shù)利用了DNA的熱變性原理。 (2)如何判斷DNA片段的擴(kuò)增是否成功？ 提示：既可用二苯胺試劑來粗略的比較擴(kuò)增前和擴(kuò)增后DNA含量的變化，也可以采用紫外分光光度法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量分析。 1．DNA復(fù)制需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。PCR中，引物長度通常為20～30個核苷酸。 2．當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度由變性后快速冷卻到55

15、 ℃左右時，引物與模板可結(jié)合，一般不需要考慮解開的兩個DNA模板鏈的重新結(jié)合，原因是：①模板DNA鏈比引物長得多而且復(fù)雜得多，不易重新結(jié)合；②引物和模板之間的碰撞機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會；③加入的引物的量足夠大，而模板鏈數(shù)量少。 3．實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng) (1)PCR所用的緩沖液配制一定要嚴(yán)格，或者直接購買專用擴(kuò)增緩沖液。 (2)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。 (3)在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，取液器上的槍頭必須更換。 (4)PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意各種反應(yīng)成分的用量，用量不當(dāng)、漏加成分

16、、PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?，均有可能?dǎo)致DNA片段擴(kuò)增的失敗。 (5)PCR擴(kuò)增的是位于兩種引物之間的DNA片段，合理設(shè)計(jì)引物是PCR成功的關(guān)鍵。 突破1　PCR實(shí)驗(yàn)操作 1．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、緩沖液以及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是(　　) A．反復(fù)洗滌　　　　　　 B．用酒精擦洗 C．高壓滅菌 D．在－20 ℃儲存 解析：選C。為了避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需的試劑從冰箱內(nèi)拿出，放在冰塊上緩慢融化。 突破2　DNA

17、分子的測定 2．在DNA鑒定過程中加入的試劑是(　　) A．雙縮脲試劑 B．斐林試劑 C．二苯胺試劑 D．甲基綠 解析：選C。雙縮脲試劑鑒定蛋白質(zhì)生成紫色，A錯誤；斐林試劑鑒定還原性糖生成磚紅色，B錯誤；二苯胺試劑鑒定DNA生成藍(lán)色，C正確；甲基綠鑒定細(xì)胞中DNA的分布，生成綠色，D錯誤。 核心知識小結(jié) [網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建] [關(guān)鍵語句] 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，簡稱PCR，是一種在體外快速擴(kuò)增目的基因或DNA序列的技術(shù)。 PCR擴(kuò)增過程中要進(jìn)行無菌操作，避免污染，且向離心管中加入模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。 變性是在94 ℃高溫下使模板雙

18、鏈DNA解旋。 退火是將反應(yīng)體系溫度降至55 ℃，使引物與模板DNA鏈配對。 延伸是將反應(yīng)體系溫度回升至72 ℃左右，在TaqDNA聚合酶作用下，使引物鏈延伸，形成互補(bǔ)的DNA雙鏈。 DNA分子的測定：DNA分子＋二苯胺試劑藍(lán)色物質(zhì)。 [隨堂檢測] [學(xué)生用書P59] 知識點(diǎn)一　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序 1. 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷30多次下述循環(huán)：90～95 ℃下使模板DNA變性、解鏈→55～60 ℃下退火(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→70～75 ℃下引物鏈延伸。下列有關(guān)PCR過程的敘述中，不正確的是(　　) A．變性

19、過程中被切斷的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵 B．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 C．退火過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成 D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高 解析：選B。變性過程的目的是解鏈，與解旋酶的作用相同，所以變性過程中被切斷的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，A項(xiàng)正確；PCR技術(shù)是在較高溫度條件下進(jìn)行的，該過程需要熱穩(wěn)定TaqDNA聚合酶，且由于該過程的產(chǎn)物是DNA，所以需要的原料是四種游離的脫氧核苷酸，故B項(xiàng)錯誤；退火過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成的，C項(xiàng)正確；PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比

20、所需要酶的最適溫度較高，D項(xiàng)正確。 2．下圖是PCR反應(yīng)過程中哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A．第一次循環(huán) B．第二次循環(huán) C．第三次循環(huán) D．第四次循環(huán) 解析：選A。在PCR反應(yīng)中，以引物為標(biāo)記，第一次循環(huán)時加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每個子代DNA中只有一種引物。 知識點(diǎn)二　目的DNA片段的體外擴(kuò)增與鑒定 3．下列關(guān)于DNA雙鏈的敘述，錯誤的是(　　) A．通常將DNA的羥基末端稱為5′端，而磷酸基團(tuán)末端稱為3′端 B．通常將DNA的羥基末端稱為3′端，而磷酸基團(tuán)末端稱為5′端 C．通常DNA只

21、能從3′端延伸DNA鏈 D．通常DNA不能從5′端延伸DNA鏈 解析：選A。通常將DNA的羥基末端稱為3′端，磷酸基團(tuán)末端稱為5′端。 4．下列關(guān)于操作過程的敘述中，錯誤的是(　　) A．PCR反應(yīng)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 B．PCR緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20 ℃儲存 C．PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換 解析：選C。為避免外源DNA等因素污染，PCR反應(yīng)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌，A正確。PC

22、R緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20 ℃儲存，使用前，將所需試劑從冰箱取出，放在冰塊上緩慢融化，B正確，C錯誤。微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換，以免其他成分污染，D正確。 5．DNA遇二苯胺(沸水浴)會染成(　　) A．磚紅色　　　 B．橘黃色 C．紫色 D．藍(lán)色 解析：選D。DNA遇二苯胺(沸水浴)會染成藍(lán)色，D正確。還原糖與斐林試劑水浴加熱生成磚紅色沉淀，A錯誤。脂肪被蘇丹Ⅲ染液染成橘黃色，B錯誤。蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑生成紫色化合物，C錯誤。 6．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)?？捎糜谶z傳疾病的診斷、刑偵破案、古生

23、物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等方面?；卮鹨韵聠栴}： (1)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程中，引物的作用是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________， 而且DNA復(fù)制的前提是________。 (2)PCR利用了________原理，可通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合。 (3)PCR技術(shù)用到的酶是________________，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制

24、時發(fā)揮相同作用的酶相比區(qū)別在于______________________。 (4)下面表格是DNA體內(nèi)復(fù)制與PCR反應(yīng)的部分比較結(jié)果。通過比較分析，請推導(dǎo)出PCR反應(yīng)合成DNA子鏈時能量來源于_____________________________________________________。 原料 ATP DNA體 內(nèi)復(fù)制 四種脫氧核苷酸 需要 PCR反應(yīng) 脫氧胞苷三磷酸、脫氧腺苷三磷酸 脫氧胸苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸 不需要 (5)假如PCR反應(yīng)所用的引物含有放射性、模板不具有放射性，且引物不被切除，則經(jīng)過n次循環(huán)，具有放射性的脫氧核苷酸鏈占總鏈

25、數(shù)的比值為________________________________________________________________________。 解析：(1)DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，復(fù)制時遵循堿基互補(bǔ)配對原則，所以打開氫鍵，DNA聚合酶方可在引物的引導(dǎo)下從引物3′端開始連接脫氧核苷酸。(2)PCR技術(shù)就是模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的一項(xiàng)技術(shù)，只不過該技術(shù)中雙鏈的解旋與結(jié)合是通過溫度來控制的，原因在于DNA具有熱變性。(3)TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性。(4)DNA無論是體內(nèi)復(fù)制還是體外復(fù)制，子鏈合成過程中都要消耗能量，而PCR反應(yīng)不加入ATP供能，且加入的原料也不是四種脫氧核苷酸，

26、可見PCR所用原料在水解成相應(yīng)脫氧核苷酸時，能釋放出等同于ATP水解的能量。(5)DNA復(fù)制n次產(chǎn)生2n個DNA，共有2n＋1條脫氧核苷酸鏈，由于母鏈不具有放射性，所以具有放射性的脫氧核苷酸鏈占總鏈數(shù)的比值為＝＝。 答案：(1)使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸　解開雙鏈(或打開氫鍵) (2)DNA的熱變性 (3)Taq DNA聚合酶　耐高溫 (4)所用原料水解產(chǎn)生相應(yīng)脫氧核苷酸時所釋放的能量 (5) [課時作業(yè)] [學(xué)生用書P95(單獨(dú)成冊)] 一、選擇題 1．TaqDNA聚合酶的特點(diǎn)是(　　) A．耐高溫　　　　　　 B．耐鹽酸 C．耐強(qiáng)堿 D．不耐熱

27、 解析：選A。TaqDNA聚合酶的特點(diǎn)是耐高溫。 2．標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、退火、延伸三大步，這三大步所需的溫度依次是(　　) A．94 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、55 ℃、92 ℃ C．55 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、55 ℃、72 ℃ 解析：選A。當(dāng)溫度上升到94 ℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈，稱之為變性；當(dāng)溫度下降到55 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度上升至72 ℃時，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。 3．有關(guān)DNA聚合酶與R

28、NA聚合酶的說法，不正確的是(　　) A．均以DNA的兩條鏈作為模板 B．均可催化形成磷酸二酯鍵 C．均以氨基酸作為基本組成單位 D．催化生成的產(chǎn)物不相同 解析：選A。DNA聚合酶催化合成DNA時，以DNA分子的兩條鏈為模板；RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄合成mRNA時，以DNA分子的一條鏈為模板，A錯誤；由于磷酸與五碳糖是通過磷酸二酯鍵相連，所以DNA聚合酶與RNA聚合酶都是通過形成磷酸二酯鍵逐個連接上核苷酸，B正確；DNA聚合酶與RNA聚合酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)，都以氨基酸作為基本組成單位，C正確；DNA聚合酶催化合成DNA，RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄合成mRNA，D正確。 4．下列哪項(xiàng)不是多聚酶鏈

29、式反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段的必需條件(　　) A．模板DNA片段和四種游離脫氧核苷酸 B．核糖體和DNA解旋酶 C．耐熱的DNA聚合酶和引物 D．適宜pH的緩沖液和自動溫度控制儀器 解析：選B。PCR反應(yīng)需要在一定緩沖液中進(jìn)行，另外，還需提供：DNA模板、分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶、自動溫度控制儀器。通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外進(jìn)行。 5．假設(shè)PCR反應(yīng)中，只有一個雙鏈DNA片段作為模板，在5次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少個這樣的DNA片段(　　) A．8　　　　　　　　 B．16 C．32 D．64 解析：選C。PCR反應(yīng)中，

30、DNA呈指數(shù)式增加，為2n，故5次循環(huán)后，會產(chǎn)生25即32個DNA片段。 6．下列有關(guān)PCR的描述，正確的是(　　 ) ①是一種酶促反應(yīng)?、诶肈NA的熱變性原理?、垡餂Q定了擴(kuò)增的特異性?、軘U(kuò)增片段一般以2n的方式積累?、輸U(kuò)增對象是氨基酸序列 A．①②③ B．①③④⑤ C．①②③④ D．②③④⑤ 解析：選C。PCR是一種體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)，是一種酶促反應(yīng)，利用了DNA的熱變性原理，引物決定了擴(kuò)增的特異性，擴(kuò)增片段一般以2n的方式積累，C正確。 7．PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是(　　) ①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA ②PC

31、R過程不需要DNA聚合酶 ③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的 ④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制 A．③④　　　　　　　 B．①② C．①③ D．②④ 解析：選C。PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比較，主要有兩點(diǎn)不同：PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA，長度通常為15～40個核苷酸；PCR過程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的。 8．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA

32、得以迅速擴(kuò)增，其簡要過程如下圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，不正確的是(　　) A．PCR技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù) B．反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板 C．PCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴(kuò)增 D．應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變 解析：選C。PCR技術(shù)是人工合成DNA的方法，原料是脫氧核苷酸而不是核糖核苷酸。 9．以下為形成cDNA過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。據(jù)圖分析，下列說法正確的是(　　) A．催化①過程的酶是RNA聚合酶 B．④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合 C．催化②⑤過程的酶都是DNA聚

33、合酶，都能耐高溫 D．如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%，則一個雙鏈DNA中，A與U之和也占該DNA堿基含量的40% 解析：選B。①過程為逆轉(zhuǎn)錄過程，故催化①過程的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，A錯誤；④為退火過程，發(fā)生的變化是引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合，B正確；催化②過程(DNA復(fù)制)需要的酶是DNA聚合酶，催化⑤過程(延伸)的酶是耐高溫DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶，C錯誤；根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則A—T，U—A，如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%，則一個雙鏈DNA中，A與T之和也占該DNA堿基含量的40%，而DNA分子中不含堿基U，D錯誤。 10．退火溫度是影響PCR特異性

34、的較重要因素。變性后溫度冷卻至40～60 ℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。PCR的結(jié)果可不考慮原來解旋開的兩個DNA模板鏈的重新結(jié)合，原因不包括(　　 ) A．由于模板DNA比引物復(fù)雜得多 B．引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞 C．模板鏈加熱解旋已經(jīng)變性不可能再次結(jié)合 D．加入引物的量足夠多而模板鏈數(shù)量少 解析：選C。退火的原理是堿基互補(bǔ)配對，解旋后DNA分子變成單鏈，堿基序列未發(fā)生改變，冷卻后仍可以進(jìn)行退火，C項(xiàng)錯誤。 11．某考古學(xué)家在西伯利亞泰加林地區(qū)的冰中，發(fā)現(xiàn)了一種冰凍的已滅絕的巨大動物的肌肉。他想了解該巨型動物的DNA與現(xiàn)今印度大象的DNA的相似性，

35、于是做了如下檢測工作，其中正確的操作步驟及順序是(　　) ①降低溫度，檢測處理后形成的雜合DNA雙鏈區(qū)段 ②通過PCR技術(shù)擴(kuò)增巨型動物和大象的DNA ③把巨型動物的DNA導(dǎo)入大象的細(xì)胞中 ④在一定的溫度條件下，將巨型動物和大象的DNA水浴共熱 A．②④③ B．②④③① C．③④① D．②④① 解析：選D。要想對比兩個DNA分子的相似性，首先需要有足夠的樣本，所以先擴(kuò)增；然后在一定溫度下，使其變性，解成單鏈；再降低溫度，檢測雜合DNA雙鏈區(qū)段。 12．下圖a、b、c均為PCR擴(kuò)增的DNA片段，下列有關(guān)說法正確的是(　　) A．片段a、b、c的長度均相同 B．片段a、b

36、只是第一次循環(huán)的產(chǎn)物 C．片段c最早出現(xiàn)在第二次循環(huán)的產(chǎn)物中 D．經(jīng)過30次循環(huán)后，片段c的數(shù)量為230 解析：選C。圖中片段a、b只有一種引物，是以原始DNA鏈為模板復(fù)制而來，其長度比片段c長，A項(xiàng)不正確。由于原始模板在每次循環(huán)中均可作為模板，則每次循環(huán)都能產(chǎn)生圖中片段a、b，B項(xiàng)不正確。由于第一次循環(huán)的產(chǎn)物只有一種引物，而圖中片段c有兩種引物，則最早出現(xiàn)在第二次循環(huán)的產(chǎn)物中，C項(xiàng)正確。經(jīng)過30次循環(huán)后，得到的DNA片段總數(shù)為230，這也包括圖中的片段a、b，故D項(xiàng)不正確。 二、非選擇題 13．PCR是一種DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因擴(kuò)增和DNA序列測定。如圖是PCR技術(shù)示

37、意圖，請回答下列問題： (1)標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為__________、__________、__________三大步驟。 (2)引物是此過程中必須加入的物質(zhì)，從化學(xué)本質(zhì)上說，引物是一小段________。 (3)將雙鏈DNA________，使之變性，從而導(dǎo)致______________________。 (4)引物延伸需提供________________作為原料。 解析：(1)標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、退火、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是94 ℃、55 ℃、72 ℃。(2)引物是此過程中必須加入的物質(zhì)，從化學(xué)本質(zhì)上說，引物是一段單鏈DNA，它能與DNA母鏈的

38、一段堿基序列互補(bǔ)配對。(3)在PCR反應(yīng)過程中，當(dāng)溫度上升到94 ℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈。(4)當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到72 ℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸(A、G、C、T)在TaqDNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。 答案：(1)變性　退火　延伸 (2)單鏈DNA (3)加熱到94 ℃　雙鏈DNA解旋成兩條單鏈 (4)4種脫氧核苷酸 14．美國科學(xué)家穆里斯發(fā)明了PCR技術(shù)，它是一種DNA“復(fù)印機(jī)”，可以在數(shù)小時內(nèi)，將一個DNA復(fù)制出1 000億個，解決了檢測樣本擴(kuò)增的難題。在人類基因組計(jì)劃實(shí)施中，PCR技術(shù)使每個核苷酸的識別成本降低至5～10美元，他因發(fā)明PC

39、R技術(shù)而榮獲了諾貝爾獎。請回答下列問題： (1)在DNA擴(kuò)增時，需要大量的____________________作為原料，在耐高溫的DNA聚合酶的催化作用下，以解旋后的單鏈為____________進(jìn)行生物合成。 (2)PCR技術(shù)中，DNA分子解旋時，必須加熱，普通的酶容易________________________，科學(xué)家從溫泉中找到了耐95 ℃高溫的________________________，解決了酶重復(fù)使用的難題，使鏈?zhǔn)椒磻?yīng)成為可能。 (3)耐高溫酶的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用說明了地球生物________的重要，大自然的________庫是人類的寶貴財(cái)富。 解析：(1)體外擴(kuò)增DNA

40、時，與體內(nèi)DNA復(fù)制需要的原料相同，即四種游離的脫氧核苷酸；同時還需要母鏈解旋后的單鏈為模板等。(2)PCR技術(shù)中一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸，在DNA復(fù)制過程中需要較高的溫度，所以需要耐高溫的TaqDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶是科學(xué)家從溫泉中找到的，能夠耐95 ℃高溫。(3)耐高溫酶的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用也說明了地球上生物多樣性中基因多樣性的重要作用，體現(xiàn)了保護(hù)生物多樣性的重要意義。 答案：(1)脫氧核苷酸　模板 (2)變性(失活)　TaqDNA聚合酶 (3)多樣性　基因 15．在進(jìn)行DNA親子鑒定時，需大量的DNA，PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))可以使樣品DNA擴(kuò)

41、增，獲得大量DNA克隆分子。該技術(shù)的原理是利用DNA的半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如下圖，圖中加粗線段代表引物)。在很短時間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)室所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。據(jù)此回答下列問題： (1)圖中的變性、延伸分別是指________________________________________________________________________、 ________________________________________________________________________ _____________

42、___________________________________________________________。 (2)假設(shè)PCR反應(yīng)中的DNA模板為P，第一輪循環(huán)的產(chǎn)物2個子代DNA為N1，第二輪的產(chǎn)物4個子代DNA為N2，N1、N2中含有模板DNA單鏈的DNA分別有________個、________個。若繼續(xù)循環(huán)，該DNA片段共經(jīng)過30次循環(huán)后能形成________個DNA片段。 (3)某樣品DNA分子中引物之間的序列共含3 000個堿基對，堿基數(shù)量滿足：＝，若經(jīng)5次循環(huán)，至少需要向試管中加入______個腺嘌呤脫氧核苷酸(不考慮引物所對應(yīng)的片段)。 解析：(1)PCR技術(shù)

43、中DNA變性是指作為模板的TaqDNA雙鏈解旋形成單鏈。延伸是指在TaqDNA聚合酶的作用下，原料脫氧核苷酸聚合形成新的DNA鏈。 (2)因DNA為半保留復(fù)制方式，不管復(fù)制幾次，子代中始終有2個DNA含有模板DNA單鏈。DNA復(fù)制子代以指數(shù)式2n增長，n＝復(fù)制次數(shù)，故復(fù)制30次形成230個DNA片段。 (3)在雙鏈DNA分子中，A＝T，G＝C，由＝推出A/C＝，C＝2A ①；A＋C＝堿基總數(shù) ②，將①式代入②得：A＝1 000。1個DNA分子復(fù)制5次，增加了25－1＝31個DNA，故至少需要1 000×31＝31 000個腺嘌呤脫氧核苷酸。 答案：(1)模板DNA雙鏈解旋形成單鏈　在Ta

44、qDNA聚合酶的作用下，原料脫氧核苷酸聚合形成新的DNA鏈 (2)2　2　230 (3)31 000 16．在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題： ____________________　　____________________ (1)在相應(yīng)的橫線上寫出引物Ⅱ。 (2)在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。 (3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記，請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點(diǎn)：__

45、______________________________________________________________________ ____________________，循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為________________________________________________________________________。 (4)PCR反應(yīng)過程的前提條件是________，PCR技術(shù)利用DNA的________原理解決了這個問題。 (5)在對樣品DNA進(jìn)行分析的過程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，要去除這些組蛋白可加入的物

46、質(zhì)是________________。 解析：(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，所以引物就提供了3′端，子鏈延伸方向?yàn)?′→3′，引物Ⅰ與b鏈部分堿基互補(bǔ)，引物Ⅱ則與a鏈部分堿基互補(bǔ)，且連接到a鏈的3′端，故引物Ⅱ的結(jié)構(gòu)為5′—G—A—OH。(2)經(jīng)過一次循環(huán)后，產(chǎn)生的兩個DNA分子分別含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作為原料的四種脫氧核苷酸被32P標(biāo)記，所以新合成的子鏈均含有放射性，一次循環(huán)后的兩個DNA分子中各有一條鏈含32P，若復(fù)制n次，共產(chǎn)生單鏈2n×2，其中只有DNA母鏈不含32P，則其所占比例為2/(2n×2)＝。(4)DNA分子在80～100 ℃的溫度范圍內(nèi)變性，雙鏈解開成單鏈，當(dāng)溫度慢慢降低時，又能重新結(jié)合形成雙鏈。(5)DNA中雜質(zhì)蛋白的去除，利用酶的專一性，應(yīng)加入蛋白酶。 答案：(1)5′—G—A—OH (2)3′—C—C……A—G—5′　5′—G—G……T—C—3′ 5′—G—G……T—C—3′　3′—C—C……A—G—5′ (3)每個DNA分子各有一條鏈含32P　 (4)DNA解旋　熱變性 (5)蛋白酶 17