DNA片段的PCR擴增1為什么DNA復(fù)制需要引物？DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。DNA復(fù)制方向的示意圖2.細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分和作用是怎樣的？參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸3.細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制與體外DNA擴增(PCR技術(shù))相同嗎？兩者又有什么關(guān)聯(lián)呢？細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制與體外DNA擴增(PCR技術(shù))是不同的，兩者具體比較見下表：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR不同點解旋有解旋酶的參與，邊解旋邊復(fù)制80100 高度解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內(nèi)溫和條件高溫相同點 提供DNA復(fù)制的模板；四種脫氧核苷酸作原料；子鏈延伸的方向都是從5端到3端PCR反應(yīng)是通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。PCR反應(yīng)的實質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反應(yīng)的題目與DNA復(fù)制的原理相同，計算方法也大體相同。例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億(230)個這樣的片段。4當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度經(jīng)快速冷卻到50左右時，為什么一般不考慮解開的2個DNA模板鏈又重新結(jié)合了，這是為什么？原因是：(1)模板DNA比引物長得多、復(fù)雜得多、不易重新結(jié)合；(2)引物和模板之間的碰撞機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞；(3)加入的引物的量足夠大而模板鏈數(shù)量少，模板鏈濃度低，不易結(jié)合。5為什么PCR能有廣泛用途？除用于DNA擴增外，還有哪些用途？在生物基因組中存在著許多差異，如物種之間的差異、基因表達(dá)上的時間差異、基因表達(dá)的地域或組織差異、變異后的差異、生理和病理變化引起的差異、遺傳的差異、雜交的差異等。但這些差異只有在DNA擴增后才能被觀察出來。因此，PCR是這種差異的一種觀察方法，因而在法醫(yī)學(xué)上、在遺傳病和其他疾病的診斷、考古中人種的確定、食品質(zhì)量的確定上和基因轉(zhuǎn)移上都可使用。6.PCR的反應(yīng)過程具體是怎樣的？PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性(當(dāng)溫度上升到90 以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈)、復(fù)性(溫度下降到50 左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合)和延伸(溫度上升到72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈)三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴增。第一輪的產(chǎn)物作為第二輪的模板,經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸三步第二輪的產(chǎn)物作為第三輪的模板,經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸三步題例領(lǐng)悟TILILINGWU【例題1】 一個由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子占總數(shù)的()A1/10B1/5C1/16 D1/25解析：一個DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為2n。而DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，其特點是新形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是新形成的子鏈。這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進入兩個子代DNA分子中，這樣兩個子代DNA分子被標(biāo)記了。以后均是在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，不論經(jīng)過多少次復(fù)制，最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個DNA分子中，這樣經(jīng)過n次循環(huán)后，標(biāo)記的DNA分子中的2/2n，即1/2n1。答案：CPCR技術(shù)的實質(zhì)就是DNA分子的復(fù)制?！纠}2】 DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是()A可加快DNA的復(fù)制速度B引物可與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合C引物的5端有助于DNA聚合酶的延伸DNA鏈DDNA聚合酶只能從3端延伸DNA鏈解析：DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(OH)末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端。DNA聚合酶不能從5端開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。答案：DDNA復(fù)制是有方向的，只能由3端延伸至5端，而不能倒過來。隨堂訓(xùn)練SUITANGXUNLIAN11個PCR循環(huán)后，一個由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，可產(chǎn)生幾個含15N標(biāo)記的DNA分子()A1個B238個C2個 D4個答案：C解析：PCR的1次循環(huán)，相當(dāng)于1個DNA分子復(fù)制了1次。因為DNA的復(fù)制為半保留復(fù)制，所以形成了2個帶標(biāo)記的DNA分子。2DNA復(fù)制需要引物，在引物的輔助下，DNA的復(fù)制(延伸)方向是怎樣的()A由3端延伸至5端B由5端延伸至3端C由3端和5端都可以延伸D由DNA分子的中間氫鍵處開始延伸答案：B解析：由于DNA聚合酶只能由引物的3端延伸DNA鏈，而DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，所以引物?端對應(yīng)DNA子鏈的5端，所以從子鏈的5端向3端延伸。5