專題能力訓練十六基因工程1.(2018天津理綜)甲型流感病毒為RNA病毒,易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法,主要環(huán)節(jié)如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主細胞內增殖的能力。以病毒RNA為模板,逆轉錄成對應DNA后,利用技術擴增,并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比,改造后的基因表達時不能合成完整長度的,因此不能產生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構建重組質粒,并保存。 (2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因,其產物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合,并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的進行分子雜交鑒定,篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。 (3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞,并在補加的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA,翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,產生大量子代病毒,用于制備疫苗。 特殊tRNA基因轉錄時,識別其啟動子的酶是(單選)。 A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖,沒有致病性,因此不經滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比,該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起免疫,增強免疫保護效果。 答案:(1)PCR多肽(或蛋白質)(2)載體總RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)細胞解析:(1)利用逆轉錄得到病毒DNA后,可利用PCR技術對該DNA進行擴增。據題意,改造后的某些基因在表達時會提前終止,不能合成改造前完整長度的多肽或蛋白質。(2)導入宿主細胞的是攜帶目的基因的載體,故需將該特殊基因與載體連接。該特殊基因的表達產物是攜帶Uaa的tRNA,故檢測該基因是否表達時可提取宿主細胞的總RNA進行分子雜交。(3)(1)中改造基因表達時,因終止密碼子提前出現,無法合成子代病毒的蛋白質而不能產生子代病毒。經過(2)改造的宿主細胞,在基因表達遇到終止密碼子時,因有特殊的攜帶Uaa的tRNA與之結合,故可繼續(xù)完成翻譯表達出完整蛋白,可產生子代病毒用于制備疫苗。與正常培養(yǎng)基相比,(3)中所用培養(yǎng)基需補加Uaa。特殊tRNA基因轉錄形成RNA,所需的酶是宿主細胞的RNA聚合酶。(4)因正常宿主細胞不含特殊tRNA基因,也無Uaa,故子代病毒侵入正常細胞后,無法合成病毒蛋白質,不能表現出致病性。該病毒與不具侵染性的流感疫苗相比,因其還可侵入體細胞,故除引起體液免疫外,還可引起細胞免疫。2.紫薯富含花青素,有清除體內自由基、抗癌、預防衰老等保健功效。研究人員通過現代分子技術手段,克隆了控制紫薯的著色基因BL?；卮鹣铝袉栴}。(1)獲取基因BL的方法之一是利用PCR技術擴增大量的DNA。此方法使用的DNA聚合酶與生物體內的DNA聚合酶相比,最主要的特點是。PCR技術能把某一DNA片段進行擴增,依據的原理是。 (2)PCR過程中復性溫度必須根據引物的堿基數量和種類來設定。下表為根據模板設計的兩對引物序列,右上圖為引物與模板結合的示意圖?？刹捎幂^高的復性溫度的是,理由是。 引物對AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAC引物對BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCG(3)若想將著色基因導入另一植物中獲得紅色果實,可將獲取的BL基因插入Ti質粒的上,通過農桿菌的轉化作用將目的基因導入植物的體細胞,獲得能穩(wěn)定遺傳和表達的轉基因植株。該過程的依據是。 (4)若要檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,需從轉基因植株中提取mRNA,用作探針與mRNA雜交。若,則表明目的基因轉錄出了mRNA。 答案:(1)耐高溫DNA雙鏈復制(2)引物對B引物對B中G/C含量較高(3)T-DNAT-DNA可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上(4)標記的目的基因出現雜交帶解析:(1)PCR技術使用的是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)。PCR技術能把某一DNA片段進行擴增,依據的原理是DNA雙鏈復制。(2)引物對B中G/C含量較高,可采用較高的復性溫度。(3)將獲取的目的基因插入Ti質粒的T-DNA上,T-DNA可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上。(4)若要檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,需從轉基因植株中提取mRNA,用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。若出現雜交帶,則表明目的基因轉錄出了mRNA。3.下圖為利用生物技術獲得生物新品種的過程,據圖回答下列問題。(1)在基因工程中,A表示目的基因的獲取,通過PCR技術可大量產生目的基因,PCR技術的原理是;B表示構建的基因表達載體,其組成除了目的基因外,還必須有啟動子、終止子以及等,其中啟動子是酶識別和結合的部位。 (2)BC為轉基因綿羊的培育過程,其中過程常用的方法是,使用的綿羊受體細胞為,用到的生物技術主要有動物細胞培養(yǎng)和。(3)BD為轉基因抗蟲棉的培育過程,其中過程常用的方法是,過程的原理是。要確定目的基因(抗蟲基因)導入受體細胞后,在棉花細胞中是否成功表達,從分子水平上鑒定可以采用的方法是。 答案:(1)DNA(雙鏈)復制標記基因RNA聚合(2)顯微注射法受精卵早期胚胎培養(yǎng)(或胚胎移植)(3)農桿菌轉化法植物細胞的全能性抗原抗體雜交4.某些微生物能表達黃曲霉毒素B1(AFB1)解毒酶。將該酶添加在飼料中可以降解AFB1,清除其毒性。下圖為采用基因工程技術生產AFB1解毒酶的流程圖。據圖回答問題。(1)過程中,需要用引物的原因是。 (2)構建酵母工程菌最常用的運載工具是,操作程序中的關鍵環(huán)節(jié)是。檢測酵母工程菌中AFB1解毒酶基因是否轉錄,應采用的方法。 (3)采用蛋白質工程進一步改造該酶的基本途徑是,從提高酶的活性出發(fā),設計預期的,推測應有的氨基酸序列,找到相對應的。 答案:(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3'端延伸DNA鏈(2)質粒構建基因表達載體分子雜交(3)蛋白質結構脫氧核苷酸序列解析:(1)由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3'端延伸DNA鏈,因此過程中需要用引物。(2)構建酵母工程菌時,常用的運載體是質粒,關鍵步驟是構建基因表達載體;轉錄的產物是mRNA,可以利用分子雜交法進行檢測。(3)蛋白質工程的本質是通過基因改造或基因合成,對現有蛋白質進行改造或制造一種新的蛋白質。所以其基本途徑是設計預期的蛋白質結構,推測應有的氨基酸序列,找到相對應的脫氧核苷酸序列,從而獲得活性較高的酶。5.大豆花葉病是世界性大豆病害,是造成大豆減產的重要原因。某科研小組制備了大豆花葉病毒(RNA病毒)的空衣殼蛋白(CP蛋白),生產過程大致如下。請回答問題。(1)圖中的是指。 (2)過程中應用的酶是。在此過程前,先要在大豆花葉病毒的基因文庫中查找的核苷酸序列,以便合成特異性引物。 (3)在上述生產流程中,(填序號)是基因工程生產CP衣殼蛋白的核心步驟。為檢測樣液中是否含有有效成分,在處可使用進行檢測。 答案:(1)RNA(2)Taq DNA聚合酶CP蛋白基因(控制CP蛋白合成的RNA片段)(3)CP蛋白的抗體6.下面為DNA的粗提取和鑒定實驗的相關操作。請回答下列問題。實驗材料A洗凈切成小塊加入二氧化硅和B研磨研磨液過濾后得濾液C(1) 圖中實驗材料A可以是等,研磨前加入的B應該是。 (2) 通過上圖所示步驟得到濾液C后,再向濾液中加入物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液,目的是;然后過濾得到濾液D,向濾液D中加入蒸餾水的目的是。(3)在該實驗中,將含有一定雜質的DNA絲狀物分別放入體積為2 mL的4種溶液中,經攪拌后過濾,獲得如下表所示的4種濾液。含DNA最少的是濾液。 1B液攪拌研磨后過濾濾液E2物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液中攪拌后過濾濾液F3物質的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液中攪拌后過濾濾液G4冷卻的體積分數為95%的酒精溶液中攪拌后過濾濾液H(4)DNA鑒定的原理是。 答案:(1)洋蔥(菜花等)洗滌劑和食鹽(2)使DNA溶解使DNA(溶解度下降而沉淀)析出(3)H(4)在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺會被染成藍色解析:(1)選用洋蔥、菜花等植物材料提取DNA時,要在切碎的材料中加入一定的洗滌劑和食鹽,并進行充分攪拌和研磨。(2)DNA在物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液中的溶解度較高,而在物質的量濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向濾液中加入物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解,過濾除去不溶的雜質。向濾液中加入蒸餾水可降低NaCl溶液的濃度,使DNA析出,除去溶解在低鹽溶液中的雜質。(3)DNA不溶于冷酒精,可利用這一原理進一步提純DNA。(4)鑒定DNA的原理是在沸水浴的條件下,DNA遇二苯胺會被染成藍色。7.苜蓿是目前我國種植最廣的豆科牧草,但是病菌往往威脅著苜蓿的生長。為了提高產量,研究人員將溶菌酶基因(LYZ基因)和綠色熒光蛋白基因(GFP基因)連接為LYZGFP基因,利用農桿菌轉化法將其導入苜蓿細胞中,并通過組織培養(yǎng)成功獲得了抗病植株。圖1表示Ti質粒,其中Vir區(qū)的基因產物是T-DNA轉移的必備條件;圖2表示含有LYZGFP基因的DNA片段,圖中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。回答下列問題。圖1圖2(1)構建含有LYZGFP基因的重組質粒時,應選用限制酶進行切割,原因是   。 (2)據圖分析,在培育轉基因苜蓿植株過程中,應選擇LYZGFP基因中的GFP基因作為標記基因,而不選擇質粒中原有的卡那霉素抗性基因為標記基因,這種做法的優(yōu)點是。 (3)在組織培養(yǎng)過程中,對愈傷組織進行顯微檢測,若,則表明細胞中GFP基因存在并表達。 (4)對該苜蓿植株進行病菌接種實驗,通過觀察其抗病程度可以進行個體生物學水平的鑒定,原因是。 答案:(1)和用限制酶和限制酶切割能獲取LYZGFP基因,不會破壞質粒中的Vir區(qū)的基因,使目的基因的插入位點位于T-DNA片段上(2)LYZGFP基因在T-DNA片段上,能整合到苜蓿細胞染色體的DNA上,便于追蹤檢測LYZ基因的表達情況(3)觀察到綠色熒光(4)LYZ基因能夠表達出溶菌酶,溶菌酶能夠殺滅病菌,表現出抗病特性- 5 -