基因工程精選大題例：（2018全國卷II)某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊(duì)將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5末端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為甲），并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點(diǎn)的示意圖如下，圖中E1E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同?；卮鹣铝袉栴}：（1）據(jù)圖推斷，該團(tuán)隊(duì)在將甲插入質(zhì)粒P0時(shí)，使用了兩種限制酶，這兩種酶是_。使用這兩種酶進(jìn)行酶切是為了保證_，也是為了保證_。（2）將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了_和_過程。（3）為了獲得含有甲的牛，該團(tuán)隊(duì)需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的_移入牛的_中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。（4）為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進(jìn)行鑒定。在鑒定時(shí)應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的_（填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”）作為PCR模板?！敬鸢浮浚?）E1和E4 甲的完整甲與載體正確連接（2）轉(zhuǎn)錄翻譯（3）細(xì)胞核去核卵母細(xì)胞（4）核DNA【解析】（1）要保證目的基因在受體細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，目的基因的首端應(yīng)有啟動(dòng)子，尾端應(yīng)有終止子。甲是將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5末端而獲得的L1-GFP融合基因，據(jù)此結(jié)合題意并分析圖示可知：該團(tuán)隊(duì)在將甲插入質(zhì)粒P0時(shí)，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進(jìn)行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶，是E1和E4。（2）構(gòu)建的真核表達(dá)載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達(dá)產(chǎn)物“某種熒光蛋白（GFP）”在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光。若在導(dǎo)入P1的牛皮膚細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了表達(dá)?；虻谋磉_(dá)過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。（3）若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術(shù)，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞，并將該重組細(xì)胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛。（4）PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一種在生物體外復(fù)制特定DNA片斷的核酸合成技術(shù)。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，則應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的核DNA作為PCR模板。模擬精做1（2018屆黑龍江省普通高等學(xué)校招生全國統(tǒng)一考試仿真模擬（十)）馬鈴薯含有豐富的淀粉、氨基酸、多種維生素和無機(jī)鹽，是種植廣泛的農(nóng)作物。侵染病毒后導(dǎo)致產(chǎn)量大幅下降，培育脫毒和抗毒的馬鈴薯品種是提高產(chǎn)量的有效方法。請回答下列問題：（1）利用馬鈴薯的莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)可以獲得脫毒苗，原因在于_，該過程依據(jù)的原理是_。（2）為獲得抗病毒的馬鈴薯植株，往往采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將病毒復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)移到馬鈴薯體內(nèi)。其過程大致如圖所示：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中需要用_（酶）處理。目的基因轉(zhuǎn)錄過程中，_能使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。將目的基因?qū)腭R鈴薯細(xì)胞使用了_法，要用_處理土壤農(nóng)桿菌，使之轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)，然后將它們在緩沖液中混合培養(yǎng)以完成轉(zhuǎn)化過程。目的基因?qū)腭R鈴薯細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)，要通過檢測與鑒定，馬鈴薯的DNA上是否插入了目的基因的檢測方法是_。（3）生產(chǎn)上常將上述轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物混合播種，其目的是降低病毒的_基因頻率的增長速率?！敬鸢浮浚?）莖尖病毒極少甚至無病毒（植物）細(xì)胞具有全能性（2）限制酶（或限制性核酸內(nèi)切酶）和DNA連接酶終止子農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Ca2+DNA分子雜交技術(shù)（3）抗性【解析】（1）馬鈴薯莖尖病毒極少甚至無病毒，可以用來培養(yǎng)脫毒苗，植物組織培養(yǎng)依據(jù)的原理是植物細(xì)胞的全能性。（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，基因表達(dá)載體中的終止子使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，用Ca2+處理土壤農(nóng)桿菌，使之轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)，使外源基因容易導(dǎo)入。DNA上是否插入了目的基因的檢測方法是DNA分子雜交技術(shù)。（3）轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物混合播種，可降低抗性作物對害蟲的選擇性，使害蟲種群中的抗性基因頻率增長率減慢。2（2019屆河南省洛陽市高三上學(xué)期尖子生第一次聯(lián)考）科研人員利用胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)對干擾素基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療，其技術(shù)流程如下圖。請回答相關(guān)問題：(1)過程獲得重組胚胎之前，需要通過_技術(shù)獲得重組細(xì)胞。(2)將基因?qū)隕S細(xì)胞而不是導(dǎo)入到上皮細(xì)胞，是因?yàn)開。(3)步驟中，需要構(gòu)建含有干擾素基因的_。由于DNA復(fù)制時(shí)，子鏈只能由5向 3方向延伸，故構(gòu)建前利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取_作為引物。對干擾素基因片段和質(zhì)粒進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶的組合為_或_。(4)將步驟獲得的ES細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，選擇發(fā)_色熒光的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)。為檢測干擾素基因是否表達(dá)，可以采用_的方法?！敬鸢浮浚?）核移植（2）ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性（3）基因表達(dá)載體B和CHind和PstEcoR和Pst（4）綠抗原-抗體雜交【解析】 (1) 圖1是利用胚胎干細(xì)胞（ES 細(xì)胞）對干擾素基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療的流程，其中過程采用了動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)。(2) 圖1中的ES細(xì)胞是取自于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。ES細(xì)胞在功能上具有發(fā)育的全能性，體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞可以使其向不同方向分化，所以將目的基因?qū)隕S細(xì)胞而不是上皮細(xì)胞。(3) 步驟是將干擾素基因（目的基因）導(dǎo)入ES細(xì)胞中，在導(dǎo)入之前需要構(gòu)建含有干擾素基因的基因表達(dá)載體。因DNA復(fù)制時(shí)，子鏈總是從5向 3方向延伸，子鏈與模板鏈反向平行，所以利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，可以從圖2的A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C片段作為引物。由圖2可以看出，用限制酶Sma切割會(huì)破壞干擾素基因，為將完整的干擾素基因切割下來，需要利用限制酶組合Hind和 Pst或 EcoR和 Pst切割干擾素基因的兩端，這樣也可以使如圖3所示質(zhì)粒上保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，即綠色熒光蛋白基因。(4) 綜上分析，在構(gòu)建的重組質(zhì)粒上，紅色熒光蛋白基因的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，但綠色熒光蛋白基因的結(jié)構(gòu)完整，因此將步驟獲得的 ES 細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)選擇只發(fā)綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)。為檢測干擾素基因是否表達(dá)，需采用抗原-抗體雜交技術(shù)，若有雜交帶出現(xiàn)，表明干擾素基因已經(jīng)成功表達(dá)。3（2019屆河南省示范性高中高三上學(xué)期期終考試）馬鈴薯是全球第四大重要的糧食作物，僅次于小麥、水稻和玉米。近年來對馬鈴薯育種的研究越來越多。請回答下列問題(1)馬鈴薯在無性繁殖過程中感染的病毒易傳播給后代，從而影響后代的產(chǎn)量和品質(zhì)，可采用_技術(shù)來脫除病毒，原因是_。(2)科學(xué)家常采用_法將控制HPV-16病毒(人宮頸癌病毒)外殼蛋白合成的基因?qū)腭R鈴薯細(xì)胞，培育出可生產(chǎn)的且抗該病毒的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，人食用后可獲得抗性。若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要構(gòu)建基因表達(dá)載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是_、_。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯經(jīng)烹煮后抗病毒效果較差，分析其原因可能是。(3)轉(zhuǎn)基因食品的安全性備受關(guān)注，若要確定某食品是不是轉(zhuǎn)基因生物或是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)加工而成的，可以從_、_等方面進(jìn)行檢測?！敬鸢浮浚?）莖尖組織培養(yǎng)植物分生區(qū)附近如莖尖的病毒極少，甚至無病毒（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化目的基因無復(fù)制原點(diǎn)目的基因無表達(dá)所需的啟動(dòng)子烹煮時(shí)，高溫破壞了病毒外殼蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使其抗病毒的功能喪失（3）檢測其是否含有外源基因或DNA 檢測其是否含有外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)【解析】（1）根據(jù)分析可知，馬鈴薯莖尖病毒極少甚至無病毒，因此可將馬鈴薯莖尖接種在培養(yǎng)基中，經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得脫毒苗。（2）馬鈴薯為雙子葉植物，將目的基因?qū)腚p子葉植物細(xì)胞常用的方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。啟動(dòng)子位于基因的首端，它是RNA聚合酶結(jié)合和識(shí)別的部位，有了它才能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，由于目的基因無復(fù)制原點(diǎn)、無表達(dá)所需的啟動(dòng)子，故需要將目的基因與運(yùn)載體結(jié)合構(gòu)建形成基因表達(dá)載體，然后再導(dǎo)入受體細(xì)胞。由于目的基因表達(dá)的產(chǎn)物是病毒外殼蛋白，烹煮時(shí)，高溫破壞了病毒外殼蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使其抗病毒的功能喪失，故該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯經(jīng)烹煮后抗病毒效果較差。（3）基因工程是將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的過程。若要確定某食品是不是轉(zhuǎn)基因生物或是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)加工而成的，可以檢測其是否含有外源基因或DNA以及檢測其是否含有外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)等方面進(jìn)行檢測。4（2019屆安徽省蕪湖市高三上學(xué)期期末考試）國際水稻研究所人員從產(chǎn)量低的耐淹水稻中找到一種耐淹基因，將其移入到高產(chǎn)熱帶水稻中，終于培育出耐淹的高產(chǎn)水稻品系，其產(chǎn)量比高產(chǎn)熱帶水稻產(chǎn)量還要高。耐淹基因移入的方法可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)。請回答下列相關(guān)問題：（1）為培育耐淹的高產(chǎn)水稻品系，應(yīng)需將耐淹基因進(jìn)行體外擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中加入了熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等，還加入耐淹基因作為_，加入_作為合成DNA的原料。（2）質(zhì)粒常被用作運(yùn)載體，因?yàn)橘|(zhì)粒具有_（答2點(diǎn)即可）。構(gòu)建耐淹基因的質(zhì)粒表達(dá)載體時(shí)，常用不同的限制酶對耐淹基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割，目的是_。（3）根據(jù)耐淹基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，研究人員通過對它的氨基酸序列設(shè)計(jì)并人工合成耐淹基因。與水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在結(jié)構(gòu)上缺少了_。雖然兩種基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物不同，但最終表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)，可能原因是_。（4）蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)的原因是_?！敬鸢浮浚?）模板 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) （2）能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定存在；具有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)，方便剪切；具有標(biāo)記基因，便于檢測和篩選減少耐淹基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、增大耐淹基因正向（正確）連接的概率（3）啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子密碼子具有簡并性（4）改造基因易于操作且改造后能夠遺傳【解析】 (1)利用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增耐淹基因（目的基因）時(shí)，在PCR反應(yīng)體系中除了加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等外，還加入耐淹基因作為模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 作為合成DNA的原料。(2) 質(zhì)粒被用作運(yùn)載體，應(yīng)具備的條件有：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定存在；具有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)，方便剪切；具有標(biāo)記基因，便于檢測和篩選。構(gòu)建耐淹基因的質(zhì)粒表達(dá)載體時(shí)，用不同的限制酶對耐淹基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割，可以減少耐淹基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、使耐淹基因定向連接到質(zhì)粒上，以增大耐淹基因正向（正確）連接的概率。(3) 與水稻的耐淹基因相比，根據(jù)耐淹基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測出的mRNA分子中，缺乏與基因中的啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子相對應(yīng)的堿基序列，據(jù)此設(shè)計(jì)并人工合成的耐淹基因在結(jié)構(gòu)上缺少了啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子。由于密碼子具有簡并性，雖然兩種基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物不同，但最終能夠表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)。(4)由于直接改造的蛋白質(zhì)不能遺傳，而改造基因易于操作且改造后能夠遺傳，所以在蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)。5