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1、解讀《限制性核酸內(nèi)切酶應(yīng)用的考點(diǎn)例析》 我們知道限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）是指能識別DNA中特定堿基順序，并在特定位點(diǎn)切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。它在生物學(xué)中應(yīng)用相當(dāng)廣泛，是基因工程中的工具酶，用來構(gòu)建重組DNA分子，對于遺傳性疾病的基因定位和基因診斷的研究也具有重要的應(yīng)用價值。下面我們以問題的形式簡要地了解它在這些方面的應(yīng)用。 1。限制酶的特點(diǎn) 例1．下面哪項(xiàng)不具有限制酶識別序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATC CTTAAG CCCCGGGG GACGT

2、C GATTTAG 解析：限制酶識別的各種序具有回文對稱的特點(diǎn)。所謂回文對稱序列就是當(dāng)以不同的方向分別閱讀DNA的兩條互補(bǔ)鏈時，DNA的兩條鏈上的堿基序列相同。如A中的DNA分子，其中一條鏈從左向右閱讀堿基序列是GAATTC，另一條互補(bǔ)鏈從右向左閱讀堿基序列也是GAATTC。 答案：D 例2．限制酶HindⅢ酶切DNA的識別序列是AAGCTT，限制酶HpaⅡ酶切DNA的識別序列是CCGG。假定DNA分子中A、T、G、C所含的比例相等，那么，限制酶HindⅢ酶切割雙鏈DNA的概率是 ，酶切位點(diǎn)間的平均距離約 kb（千堿基）；限制酶

3、HpaⅡ酶切割雙鏈DNA的概率是 ，酶切位點(diǎn)間的平均距離約 kb。 解析：因?yàn)橄拗泼缸R別序列具有回文對稱序列的特點(diǎn)，這兩個序列在相應(yīng)的互補(bǔ)鏈上又會呈現(xiàn)，因此我們只需考慮DNA的一條鏈即可。六堿基長HindⅢ識別序列AAGCTT出現(xiàn)的概率是（1/4）6或1/4096，因此HindⅢ酶切位點(diǎn)之間的平均距離大約為4 kb。同樣的道理，4堿基長的HpaⅡ酶識別序列CCGG出現(xiàn)的概率是（1/4）4或1/256，因此HpaⅡ酶切位點(diǎn)的平均距離大約為0.25 kb。 2．黏性末端與限制酶類型的關(guān)系 例3．用同一種限制酶處理會產(chǎn)生相同的黏性末端，但用不同的限制酶處理也可能

4、產(chǎn)生相同的黏性末端。下列所示的四個黏性末端是由（ ）種限制酶作用產(chǎn)生的。 解析：不同的限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)不同。要判斷題中的4個黏性末端是由幾種限制酶作用下產(chǎn)生的，不光要看共有幾種黏性末端，更重要的是要看作用產(chǎn)生這些黏性末端的限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)是否相同。經(jīng)過分析，題中4幅圖所示的黏性末端應(yīng)該分別是由4種限制酶作用產(chǎn)生的，這4種酶的識別序列及切割位點(diǎn)依次是：G↓AATTC，C↓AATTG，G↓TTAAC，C↓TTAAG。 答案：4 3．限制酶圖譜分析 例4．一線性DNA分子分別用限制酶HindⅢ和SmaⅠ消化，然后用這兩種酶混合消化，得到如下片段： Hind

5、Ⅲ 2.5 kb，5.0 kb SmaⅠ 2.0 kb，5.5 kb HindⅢ和SmaⅠ 2.5 kb，3.0 kb，2.0 kb （1）畫出此絲性DNA分子的限制酶圖譜。 （2）兩酶混合消化的片段再用限制酶EcoRⅠ消化，結(jié)果導(dǎo)致凝膠上3.0 kb的片段消失，產(chǎn)生一個1.5 kb的新片段。請標(biāo)出限制酶EcoRⅠ在限制酶圖譜上的切割位點(diǎn)。 解析：（1）用限制酶HindⅢ消化DNA得到2.5 kb與5.0 kb兩個片段，如果加入雙酶HindⅢ和SmaⅠ得到2.5 kb，3.0 kb，2.0 kb三個片段，這說明限制酶SmaⅠ能將Hi

6、ndⅢ消化DNA得到5.0 kb片段切割為3.0 kb和2.0 kb片段。據(jù)此，可畫出如下限制酶圖譜。 （2）因?yàn)橹挥?.0 kb的片段消失，并且生成一個新的1.5 kb的片段，表明此片段有一個EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，且位于此片段的中央。3.0 kb的片段被限制酶EcoRⅠ切成2個等長1.5 kb的片段，在凝膠上顯示出一個1.5 kb的新片段。 例4．今用PCR方法擴(kuò)增了一2kb的DNA片段，純化后用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ單獨(dú)消化，然后混合消化，凝膠電泳分離，結(jié)果如下。 EcoRⅠ 150bp，500 bp，1250 bp，100 bp HindⅢ

7、 350 bp，650 bp，1000 bp EcoRⅠ和HindⅢ 100bp ，150 bp ，200bp，300bp，350bp， 900 bp 根據(jù)以上數(shù)據(jù)，構(gòu)建此DNA片段的限制酶圖譜。 解析：雙酶消化表明，1250 bpEcoRⅠ酶切片段中含有一個HindⅢ酶切位點(diǎn)（產(chǎn)生350bp和900 bp兩個片段），500bpEcoRⅠ酶切片段含有一個HindⅢ酶切位點(diǎn)（產(chǎn)生200kbp和300bp兩個片段）；350bp，650bp和1000bpHindⅢ酶切片段各有一個EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。根據(jù)以上分析，可畫出如下限制酶圖譜。 4．基因診斷

8、 例6．一對等位基因經(jīng)某種限制酶切割后形成的DNA片段長度存在差異，凝膠電泳分離限制酶切割的DNA片段，與探針雜交后可顯示出不同的帶譜（如圖Ⅰ所示）。根據(jù)該特性，就能將它作為標(biāo)記定位在基因組的某一位置上?，F(xiàn)有一對夫婦生了四個兒女，其中1號性狀表現(xiàn)特殊（如圖Ⅱ）。由此可推知四個女兒的基因型（用D、d表示一對等位基因）正確的是（ ） A．1號為XdXd者 B．2號為XDY C．3號為Dd D．4號為DD或Dd 解析：不含有特殊性狀的雙親生出性狀表現(xiàn)特殊的1，且為女性，由此可見該特殊性狀是隱性的，并位于常染色體上，1號為dd，雙親均為Dd。從給出的“帶譜”顯示可知，雜合體顯示的DNA片段是一長一短（長/短）的，而純合體是兩長（長/長）或兩短（短/短）。1是隱性純合顯示為短，則顯性顯示的帶譜為長。 雙親為雜合子（Dd），其等位基因限制酶切后，凝膠電泳分離與探針雜交顯示兩條不同長度DNA片段（長/短）的帶譜。其“雜合性片段”完全像基因一樣，呈孟德爾式遺傳。可寫為： 親本： 長/短×長/短 ↓ 子女： 1/4長/長 2/4長/短 1/4短/短 結(jié)合后代帶譜的顯示可判斷：子女中1號為短/短（dd），2號為長/長（DD），3號為長/短（Dd），4號為長/長（DD）。 答案：C