細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 細(xì)胞器的分級(jí)分離細(xì)胞器的分級(jí)分離細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 目的要求目的要求 1掌握差速離心法和密度梯度離心法的原理。掌握差速離心法和密度梯度離心法的原理。 2 2熟悉哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體分離和熟悉哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體分離和 純化的實(shí)驗(yàn)方法。純化的實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 球形顆粒的沉降速率取決于其密度、半徑、介質(zhì)球形顆粒的沉降速率取決于其密度、半徑、介質(zhì)黏度和離心力。黏度和離心力。 差速離心法（差速離心法（differential centrifugation）是將細(xì)是將細(xì)胞勻漿在密度均一的介質(zhì)中從低速到高速離心，較大胞勻漿在密度均一的介質(zhì)中從低速到高速離心，較大顆粒先在低速離心時(shí)沉淀，再用高速離心沉淀上清液顆粒先在低速離心時(shí)沉淀，再用高速離心沉淀上清液中的小顆粒物質(zhì)，從而達(dá)到逐級(jí)分離細(xì)胞器的目的。中的小顆粒物質(zhì)，從而達(dá)到逐級(jí)分離細(xì)胞器的目的。 密度梯度離心法（密度梯度離心法（density gradient centrifugation）是一定介質(zhì)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，頂部的是一定介質(zhì)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，頂部的細(xì)胞勻漿在重力或離心力場(chǎng)的作用下分層、分離。細(xì)胞勻漿在重力或離心力場(chǎng)的作用下分層、分離。 一般先通過差速離心法將細(xì)胞器初步分離，再進(jìn)一般先通過差速離心法將細(xì)胞器初步分離，再進(jìn)一步通過密度梯度離心法分離純化細(xì)胞器。一步通過密度梯度離心法分離純化細(xì)胞器。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 細(xì)胞器的分離常通過細(xì)胞器的分離常通過組織細(xì)胞勻漿組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分級(jí)分離分離和和分析分析三個(gè)步驟完成。三個(gè)步驟完成。 分級(jí)分離方法有兩種，即：分級(jí)分離方法有兩種，即：差速離心法差速離心法和和密度梯度離心法密度梯度離心法。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 1器具：器具：玻璃勻漿器、低速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、玻璃勻漿器、低速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、天平、普通光學(xué)顯微鏡、天平、普通光學(xué)顯微鏡、1.5 ml Ep1.5 ml Ep管、載玻片、管、載玻片、10 10 mlml滴管、冰盒、冰塊、濾網(wǎng)、染缸、滴管、冰盒、冰塊、濾網(wǎng)、染缸、20 ml20 ml燒杯。燒杯。2 2材料：材料：大白鼠。大白鼠。3 3試劑：試劑：生理鹽水、生理鹽水、PBSPBS、0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液、的蔗糖溶液、0.34 mol/L0.34 mol/L蔗糖蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)2 2溶液、溶液、0.88 0.88 mol/Lmol/L蔗糖蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)2 2溶液、溶液、9595乙醇、甲乙醇、甲基綠基綠- -派洛寧染液、丙酮、派洛寧染液、丙酮、0.20.2的詹納斯綠的詹納斯綠B B。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1 1組織勻漿制備組織勻漿制備（1 1）取材）取材 將空腹將空腹121224 h24 h的大鼠處死。剖開腹部，的大鼠處死。剖開腹部， 迅速取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血污，用迅速取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血污，用 濾紙吸干。濾紙吸干。（2 2）制備勻漿）制備勻漿 稱取約稱取約1 12 g2 g左右的肝組織，用預(yù)冷左右的肝組織，用預(yù)冷 的的0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液沖洗數(shù)次，剪碎。以預(yù)的蔗糖溶液沖洗數(shù)次，剪碎。以預(yù) 冷的冷的0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液懸浮剪碎的組織，移的蔗糖溶液懸浮剪碎的組織，移 入勻漿器內(nèi)，在冰浴條件下勻漿。勻漿完成后，入勻漿器內(nèi)，在冰浴條件下勻漿。勻漿完成后， 用濾網(wǎng)過濾，即制得肝細(xì)胞勻漿，備用。用濾網(wǎng)過濾，即制得肝細(xì)胞勻漿，備用。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件2.2.細(xì)胞器的分級(jí)分離細(xì)胞器的分級(jí)分離(1)(1)細(xì)胞核的分離：細(xì)胞核的分離： 第一次第一次:1000rpm,8min:1000rpm,8min。(2)(2)細(xì)胞核的純化細(xì)胞核的純化 在沉淀中加入在沉淀中加入0.34mo1/L0.34mo1/L蔗糖蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)-0.5mmol/L Mg(Ac)2 2至至2ml2ml，混懸。用長針頭注射器在混懸液下輕輕加入，混懸。用長針頭注射器在混懸液下輕輕加入2ml 2ml 的的0.88mo1/L0.88mo1/L蔗糖蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)-0.5mmol/L Mg(Ac)2 2溶液。溶液。盡量使兩盡量使兩種溶液明顯分層種溶液明顯分層。 2000rpm2000rpm離心離心8min8min。加加0.25M0.25M蔗糖至蔗糖至4ml4ml，混勻，混勻第二次第二次:1300rpm,8min:1300rpm,8min。棄上清。棄上清上清保留于上清保留于EpEp管管1.01.0處處細(xì)胞器的分級(jí)分離課件顯微鏡下觀察結(jié)果顯微鏡下觀察結(jié)果(3)(3)細(xì)胞核鑒定：細(xì)胞核鑒定： 。分色分色: :快速放入丙酮中，蒸餾水漂洗，擦干水分快速放入丙酮中，蒸餾水漂洗，擦干水分固定：浸入固定：浸入9595的乙醇溶液的乙醇溶液5min5min，晾干，晾干染色：滴加甲基綠染色：滴加甲基綠- -派洛寧染液染色派洛寧染液染色15min15min涂片：在離心后的沉淀中加入幾滴涂片：在離心后的沉淀中加入幾滴PBSPBS，混，混勻后涂片，空氣干燥勻后涂片，空氣干燥細(xì)胞器的分級(jí)分離課件(4)(4)線粒體的分離線粒體的分離 將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清以將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清以10000 g 10000 g 離心離心10 10 minmin，將上清移入，將上清移入1.5 ml Ep1.5 ml Ep管內(nèi)并置冰上或管內(nèi)并置冰上或44冰箱待冰箱待用。沉淀用用。沉淀用0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液重懸后，的蔗糖溶液重懸后，10000 g10000 g離心離心10 min10 min，重復(fù)，重復(fù)1 1次，取沉淀。次，取沉淀。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件(2)(2)線粒體的鑒定線粒體的鑒定 于潔凈載玻片上滴于潔凈載玻片上滴1 1滴滴0.020.021 1的詹納斯的詹納斯綠綠B B染液，用牙簽挑取線粒體沉淀均勻涂于染液中，染液，用牙簽挑取線粒體沉淀均勻涂于染液中，染色染色5 510 min10 min，蓋上蓋玻片，鏡檢。，蓋上蓋玻片，鏡檢。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核經(jīng)甲基綠光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核經(jīng)甲基綠- -派洛派洛寧染色，寧染色，DNADNA呈藍(lán)綠色，核仁和胞質(zhì)呈藍(lán)綠色，核仁和胞質(zhì)RNARNA呈紅色。呈紅色。觀察分析完整細(xì)胞核的數(shù)量及其比例。線粒體經(jīng)觀察分析完整細(xì)胞核的數(shù)量及其比例。線粒體經(jīng)詹納斯綠詹納斯綠B B染色呈亮綠色。溶酶體可用酸性磷酸酶染色呈亮綠色。溶酶體可用酸性磷酸酶顯示法鑒定。光鏡下看不到溶酶體的形態(tài)特征，顯示法鑒定。光鏡下看不到溶酶體的形態(tài)特征，但可看到代表溶酶體的棕黑色顆?；驁F(tuán)塊。如果但可看到代表溶酶體的棕黑色顆?；驁F(tuán)塊。如果分離到的細(xì)胞組分符合其形態(tài)學(xué)及酶學(xué)特征，而分離到的細(xì)胞組分符合其形態(tài)學(xué)及酶學(xué)特征，而且沒有其他組分的污染，則證明分離操作成功，且沒有其他組分的污染，則證明分離操作成功，反之則為失敗。反之則為失敗。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1 1組織勻漿時(shí)，既要盡可能使細(xì)胞完全破組織勻漿時(shí)，既要盡可能使細(xì)胞完全破 碎，又要盡量快速。碎，又要盡量快速。 2 2在細(xì)胞器分離過程中，所有操作應(yīng)盡可在細(xì)胞器分離過程中，所有操作應(yīng)盡可 能在能在1 144下進(jìn)行。下進(jìn)行。 3 3實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)注意保持細(xì)胞器的完整性，避免操實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)注意保持細(xì)胞器的完整性，避免操 作過于劇烈。另線粒體進(jìn)行的是活體染色，要作過于劇烈。另線粒體進(jìn)行的是活體染色，要 求樣品制備好后盡快染色。求樣品制備好后盡快染色。細(xì)胞器的分級(jí)分離課件 作業(yè)與思考題作業(yè)與思考題 1 1分別在高倍鏡和油鏡下觀察細(xì)胞核和線粒分別在高倍鏡和油鏡下觀察細(xì)胞核和線粒 體，并繪制其結(jié)構(gòu)圖。體，并繪制其結(jié)構(gòu)圖。 2 2簡述細(xì)胞器分級(jí)分離的實(shí)驗(yàn)原理和主要步簡述細(xì)胞器分級(jí)分離的實(shí)驗(yàn)原理和主要步 驟？驟？ 3 3實(shí)驗(yàn)操作中有哪些關(guān)鍵步驟和因素影響所得實(shí)驗(yàn)操作中有哪些關(guān)鍵步驟和因素影響所得 細(xì)胞器的含量和純度？細(xì)胞器的含量和純度？