專題5課題1 DNA的粗提取與鑒定一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是選用一定的或方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。對(duì)于DNA勺粗提取而言，就是要利用DNA與RNA蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在和性質(zhì)方 面的差異，提取，去除其他成分。（1） DNA勺溶解性：（2） DNA勺溶解性：DN府口蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。此外，DNA不溶于溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNAI蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。（3） DNA寸酶、高溫和洗滌劑的耐受性：蛋白酶能水解，但是對(duì) DNAl響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受 60 80oC的高溫，而DNA在C以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解，但,對(duì)DNAB響。（二）DNA勺鑒定在條件下，DNA遇會(huì)被染成色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取凡是含有的生物材料都可以考慮，但是使用的生物組織，成功的可能性更大。（二）破碎細(xì)胞，獲取含 DNA勺濾液動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的，同時(shí)用 玻璃棒，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用溶解細(xì)胞膜。例如， 提取洋蔥的 DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的和，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收 集研磨液。（三）去除濾液中的雜質(zhì)方案一利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中的不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除 雜質(zhì)。方案二 直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng) 1015min,嫩肉粉中的能夠分解蛋白質(zhì)。方案三 將濾液放在C的恒溫水浴箱保溫1015min,注意范圍.。（四）DNA勺析出與鑒定1、將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積、的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為），靜置min,溶液中會(huì)出現(xiàn)，這就是粗提取的 DNA用玻璃棒攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。2、取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為的NaCl溶液5ml,將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的試劑。混合均勻后，將試管置于中加熱5min,待試管后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變。實(shí)例：用雞血細(xì)胞液粗提取 DNM鑒定（蘇教版必修 2）步驟操作圖示1、提取雞血 細(xì)胞的細(xì)胞 核物質(zhì)將制備好的雞血細(xì)胞液（已在課前配好）570mL注入到50ml燒杯中。向燒杯中加入 20mL同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向快 速攪拌5min,然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞過濾至1000mL的燒杯中，取其濾液。房吧E2、溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA將物質(zhì)的量濃度為 40 mL加入到濾液中，并作玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min,使其混合均勻，這時(shí) DNAa溶液中呈溶解狀 態(tài)。23、析出含DNA的粘稠 物沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入，同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地輕 輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)。繼續(xù)加入蒸儲(chǔ)水，溶液中 出現(xiàn)的黏稠物會(huì)越來越多。當(dāng)黏稠物/、再增加時(shí)停止加入蒸儲(chǔ) 水。4、濾取含DNA的粘稠 物用放多層紗布的漏斗，過濾溶液至1000 mL的燒杯中。取紗布上的。n5、將 DNA的粘稠物再 溶解取一個(gè)50 mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入物質(zhì)的量濃度為20 mL。用鈍頭鐐子將紗布上的黏稠物夾至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地?cái)嚢?3min ,使黏稠物盡可能多地溶 解于溶液中。上的尸/6、過濾含DNA的氯化 鈉溶液取一個(gè)100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾以上溶液。 取其濾液（DNA溶于中）。1 HU7、提取含雜 質(zhì)較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入的、體積分?jǐn)?shù)為或0 mL （加入時(shí)動(dòng)作要慢），并作用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，溶 液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。 當(dāng)玻璃棒上出現(xiàn)絲狀物纏繞 時(shí)，繼續(xù)慢慢攪拌，至不再增加時(shí)，用玻璃棒將絲狀物卷起， 并用濾紙吸取上面的水分。制乂冷Wr 抑酒粘般身8、DNA勺鑒士7E和兩支20 mL的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為5mLi將絲狀物放入其中一支試管中,用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后一向兩支試 詹中各加入4 mL的一苯胺試劑。混合均勻后，將試管置 于沸水中加熱 5min,等試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中 溶液顏色的變化。1 L羸1三、操作提示1、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每 100ml血液中需要加入 3g,防止。2、加入洗滌劑后，動(dòng)作要、，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入 酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要，以免加劇，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3、二苯胺試劑要，否則會(huì)影響鑒定的效果。四、課題成果評(píng)價(jià)1、是否提取出了 DNA觀察你提取的 DNA1色，如果不是白色絲狀物，說明 DNA中的較多；二苯胺鑒定出現(xiàn) 藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的 DNA或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)，需要重新制 備。2、分析DNA中的雜質(zhì)本實(shí)驗(yàn)提取的 DNAM制品有可能仍然含有、等雜質(zhì)。3、不同實(shí)驗(yàn)方法的比較對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)方法，本課題可以采用分組的方法進(jìn)行研究。首先選取不同的實(shí)驗(yàn)材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的、，二苯胺顯色的等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好五、課題延伸本課題使用的洗滌劑是多組分的混合物,在嚴(yán)格的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中很少使用。實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DAN時(shí)，通常使用、或等化學(xué)試劑?！窘滩拇鸢浮浚ㄒ唬┡詸谒伎碱}1 .為什么加入蒸儲(chǔ)水能使雞血細(xì)胞破裂？答：蒸儲(chǔ)水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞，再加上攪拌的，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA2 .加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能，有利于DNA的；食鹽的主要成分是 NaCl,有利于。3 .如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的 DNA1,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。4 .此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有、和等雜質(zhì)。5 .為什么反復(fù)地溶解與析出DNA能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA能除去；用低鹽濃度使 DNAW出，能除去。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA就能夠除去與 DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。6 .方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)，與DNA離。（二）討論題圖5-1是DNA NaCl溶液中的溶解度曲線，請(qǐng)根據(jù)曲線圖，思考下面的問題1 .在什么濃度下，DNA勺溶解度最小？ DNA NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？答：在NaCl溶液濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度最小；當(dāng) NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨著NaCl溶液濃度的升高，DNA勺溶解度；當(dāng)NaCl溶液濃度高于 O14mol/L 時(shí)，隨著NaCl溶液濃度的升高，DNA勺溶解度。2 .如何通過控制 NaCl溶.液的濃度使DNAft鹽溶液中溶解或析出？答：卞據(jù)DNAft 0.14mol/L NaCl溶液中溶解度最小的特性，一般先用較高濃度的NaCl溶液使DNA§解，然后再用蒸儲(chǔ)水稀釋至使DNAW出。（三）練習(xí)1 .答：提取DNA勺第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DN哈量的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA勺釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要；第三步是DNA勺純化，即根據(jù) DNA勺、對(duì)及的耐受性的不同 魯特性，最大限度地將 DNAJ雜質(zhì)分開；最后一步是對(duì) DNA®行鑒定，r這是對(duì) 整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。2 .答：提取蛋白質(zhì)比提取 DNA勺難度大。這是因?yàn)?，與 DNAf比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏 感得多，很容易；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)，使得蛋白質(zhì)的 提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方 法。【知識(shí)拓展】1 .制備雞血細(xì)胞液時(shí)，為什么要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉？答：制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入抗凝劑一一檸檬酸鈉，。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的 C大大減少，血液便 不會(huì)凝固。2 .雞血離心或靜置沉淀后，為什么要棄出上清液？答：因?yàn)樯锨逡菏?，沒有血細(xì)胞。DNAi要存在于試管底部的中，所以提取雞血中的DNA時(shí)，要除去血液中的上清液。3 .盛放雞血細(xì)胞液的容器最好是塑料容器，為什么？答：雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的 DNA容易被玻璃容器吸附， 由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來 就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過程中最好使用的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA勺損失。4 .為什么析出 DNA時(shí)要用冷卻 的酒精？ 答：預(yù)冷的酒精溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNM子的柔韌性，減少斷裂。