_TiO2納米管載pH響應(yīng)型膠束藥物控釋體系的研究(面上項(xiàng)目)1、立項(xiàng)的背景和意義 牙列缺損及牙列缺失是口腔患者的常見(jiàn)病、多發(fā)病，不僅直接降低患者的咀嚼效率，同時(shí)對(duì)患者的顏面部外形、全口牙齒咬合的穩(wěn)定性、全身營(yíng)養(yǎng)的均衡都有一定的影響。隨著生活質(zhì)量水平的不斷提高,人們對(duì)牙齒修復(fù)體的要求已經(jīng)不僅僅是滿(mǎn)足于簡(jiǎn)單的咀嚼功能的恢復(fù)，更要求在修復(fù)過(guò)程中不損傷天然牙，修復(fù)體更舒適，修復(fù)牙齒更逼真等。因此，以鈦材為基礎(chǔ)的骨內(nèi)種植技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，成為牙列缺損、牙列缺失和頜面部缺損最有效的修復(fù)手段之一，種植義齒以其不損傷臨牙，美觀，咀嚼功能強(qiáng)等不可替代的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)作為牙列缺損及缺失重要的修復(fù)方式被廣泛應(yīng)用于口腔臨床治療。隨著優(yōu)質(zhì)鈦合金的出現(xiàn)及鈦合金表面改性技術(shù)的發(fā)展，鈦合金以其優(yōu)異的綜合性能（良好的生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、鈍化能力、抗腐蝕性、與骨組織相近的低彈性模量等）成為牙種植體、頜面贗復(fù)體固定樁、骨內(nèi)植入式假肢以及各種矯形材料等人體硬組織替代物和修復(fù)物的首選材料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)植入牙種植體數(shù)百萬(wàn)顆，人工關(guān)節(jié)、脊柱裝置、冠脈支架數(shù)十萬(wàn)件，骨折內(nèi)固定器械數(shù)百萬(wàn)套。然而，由此引起的植入物相關(guān)性感染問(wèn)題也逐漸凸顯出來(lái)，成為臨床上一個(gè)非常棘手的問(wèn)題1。牙種植體由植體、穿齦部分及上部結(jié)構(gòu)三部分組成，植體材料基本為商業(yè)純鈦或TC4鈦合金，鈦植體經(jīng)應(yīng)力分析對(duì)材料形態(tài)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)，表面采用不同技術(shù)處理以增大比表面積及使其在體內(nèi)容易形成類(lèi)骨磷灰石（BLA）層，已實(shí)現(xiàn)材料與骨的化學(xué)性鍵合，其抗剪切力達(dá)50Mpa以上，完全可滿(mǎn)足負(fù)重、承載修復(fù)體的應(yīng)用要求；上部結(jié)構(gòu)的修復(fù)可根據(jù)不同口腔情況的要求，基本實(shí)現(xiàn)形態(tài)和功能并舉的目標(biāo)。但在實(shí)際應(yīng)用中，牙種植體仍有較高失敗率，其基本表現(xiàn)為牙齦附著下移或牙周袋形成，牙槽骨吸收，最終種植體松動(dòng)、脫落。大量報(bào)道對(duì)種植體失敗的原因進(jìn)行了分析，除應(yīng)力過(guò)載或屏蔽致骨吸收外，種植體周?chē)椎陌l(fā)生和發(fā)展是其最終失敗的重要表現(xiàn)和主要原因。因此，尋找有效的方法消除種植體相關(guān)感染具有非常重要的臨床意義，對(duì)鈦合金種植體進(jìn)行表面改性研究十分必要。種植體表面易感染的主要有兩方面原因：一、表面生物膜的形成；二、種植體/組織界面免疫能力低下。鈦種植體在生理環(huán)境下其表面會(huì)吸附一層蛋白層，使鈦表面適合于細(xì)菌聚集和生物膜形成2-3。生物膜是指附著在物質(zhì)表面的微生物實(shí)體，是細(xì)菌在復(fù)雜多變的環(huán)境中，產(chǎn)生外部多糖包膜多聚體，使細(xì)菌相互粘連形成膜狀物，它可以通過(guò)多種機(jī)制保護(hù)其內(nèi)部的細(xì)菌不受攻擊3。此外，在種植體植入后的早期，種植體/組織界面血管分布量較少，防御能力較低，有利于細(xì)菌入侵從而發(fā)生感染。種植體手術(shù)的病人臨床上常規(guī)會(huì)給予全身抗生素預(yù)防性治療以阻止感染的發(fā)生4,5。然而，全身抗生素給藥具有許多缺點(diǎn)，如靶點(diǎn)藥物濃度低和全身毒副作用等。因此，從這些角度考慮局部抗生素給藥更有優(yōu)勢(shì)。目前已有多種方法實(shí)現(xiàn)植入體表面局部緩釋給藥，如在種植體表面制備各種涂層6-7，采用共價(jià)結(jié)合的方法將藥物固定在鈦表面等方法8；但是這些緩釋方法存在藥物載量少，且涂層易剝脫等缺點(diǎn)。 近年來(lái)一種新的局部藥物緩釋設(shè)計(jì)理念是在鈦種植體表面用陽(yáng)極氧化法形成TiO2（二氧化鈦）納米級(jí)小管作為局部“藥物納米儲(chǔ)存緩釋器”，為種植體局部藥物緩釋提供了新思路9。藥物在TiO2 納米管中的釋放主要受管孔結(jié)構(gòu)支配（直徑和長(zhǎng)度比），納米管長(zhǎng)徑比對(duì)于藥物釋放率起著決定性作用，可以有效延遲或加速藥物釋放10。目前延長(zhǎng)藥物釋放的方法主要是減小TiO2 納米管徑，通過(guò)降低藥物釋放率來(lái)延長(zhǎng)釋放持續(xù)時(shí)間，但是此法存在降低藥物裝載總量、納米管直徑調(diào)控范圍有限（20-300nm），“突釋”現(xiàn)象明顯以及很難滿(mǎn)足長(zhǎng)時(shí)間（數(shù)周）藥物連續(xù)釋放的臨床需求等缺點(diǎn)11。因此，如何增加可控孔徑范圍內(nèi)TiO2納米管的藥物裝載總量，達(dá)到藥物緩釋的可控性，實(shí)現(xiàn)植入體表面緩釋給藥從而達(dá)到有效控制種植體周?chē)资种匾?近年來(lái)，生物可降解聚合物膠束作為納米藥物載體備受矚目12-14。它能包裹疏水性藥物，提高藥物在水中的溶解度，延長(zhǎng)藥物在體液中的循環(huán)時(shí)間另外，聚合物膠束的尺寸一般為10200nm，處于TiO2納米管直徑調(diào)控范圍之內(nèi)（20-300nm），裝載入TiO2納米管內(nèi)可以避免聚合物膠束過(guò)早地 被腎臟清除和機(jī)體免疫系統(tǒng)吞噬，局部用藥可降低全身藥物副作用和改善藥物利用率15值得注意的是，單純TiO2納米管裝載聚合物膠束無(wú)法控制藥物的釋放量為靶向位點(diǎn)提供有效的藥物濃度。刺激響應(yīng)性膠束可根據(jù)內(nèi)部刺激（如pH、氧化還原電位、溶酶體酶）或外部刺激（如溫度、磁場(chǎng)、光）快速響應(yīng)，如溶解、溶脹或坍塌，從而達(dá)到在合適時(shí)間釋放藥物的目的，提高治療療效。在這些刺激中，pH響應(yīng)性是使用最廣泛的, 在正常人體組織，ph值在7.4，某些病理狀態(tài)(如炎癥)下，病灶組織局部由于缺氧導(dǎo)致無(wú)氧代謝而被酸化，pH值降低，在種植體穿齦或穿皮部位，由與細(xì)菌大量產(chǎn)酸，在菌斑內(nèi)ph值甚至低至5.5。因此，低pH值被視為炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志之一。因此，我們可以利用正常組織和炎癥組織的ph值差異，設(shè)計(jì)一種能對(duì)環(huán)境中pH值做出響應(yīng)的TiO2納米管加載聚合物膠束的藥物緩釋系統(tǒng)。 綜上所述，充分利用TiO2納米管結(jié)構(gòu)的可控性、聚合物膠束良好的穩(wěn)定性、藥物包封率及腙鍵的pH響應(yīng)性能等優(yōu)勢(shì)，結(jié)合兩者的優(yōu)勢(shì)對(duì)鈦基體表面進(jìn)行改性研究，從而達(dá)到鈦種植體表面pH智能響應(yīng)型藥物緩釋的目的，降低藥物全身副作用，改善藥物利用率。本項(xiàng)目在前期已成功采用陽(yáng)極氧化法在純鈦基體表面制備TiO2納米管陣列，針對(duì)不同電壓、電解質(zhì)濃度、陽(yáng)極氧化時(shí)間等因素對(duì)制備不同管徑、長(zhǎng)度TiO2納米管陣列的影響做了初步的實(shí)驗(yàn)和探討，確定參數(shù)后制備結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的TiO2納米管，采用簡(jiǎn)易真空凍干法成功在TiO2納米管內(nèi)直接加載阿莫西林，通過(guò)SEM、XRD、EDS觀測(cè)等手段對(duì)TiO2納米管進(jìn)行表面觀測(cè)及結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)在緩沖溶液中模擬體外藥物釋放，證實(shí)了鈦表面TiO2納米管結(jié)構(gòu)直接裝載藥物呈現(xiàn)出藥物“突釋”現(xiàn)象，本項(xiàng)目擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用聚合物膠束良好的藥物包封率和pH智能響應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，改善TiO2納米管載藥“突釋”現(xiàn)象，從而建立一種新型種植體周抗炎藥物緩釋體系并實(shí)現(xiàn)釋放速率的調(diào)控，模擬正常生理過(guò)程中出現(xiàn)種植體周?chē)讜r(shí)藥物的響應(yīng)性釋放，最大限度的降低種植體周?chē)讓?duì)種植體初期愈合產(chǎn)生的不良影響，促進(jìn)種植體早期愈合、提植成功率。2、國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 陽(yáng)極氧化是指金屬或合金的電化學(xué)氧化。在相應(yīng)的電解液和特定的工藝條件下，由于外加電流的作用下，將金屬或合金的制件作為陽(yáng)極，采用電解的方法使其表面形成氧化物薄膜。雖然陽(yáng)極氧化的歷史已經(jīng)超過(guò)50年，但直到1995年，人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)優(yōu)化陽(yáng)極氧化條件可以形成高度有序孔陣列的氧化膜。1999年，Zwilling16等第一次報(bào)道了在含氟離子溶液中，鈦表面經(jīng)過(guò)電化學(xué)陽(yáng)極氧化得到TiO2納米管陣列。TiO2納米管制備設(shè)備要求較低，并可通過(guò)調(diào)整制備電壓、電解質(zhì)濃度、陽(yáng)極氧化時(shí)間、pH值等參數(shù)獲得一定管徑和管長(zhǎng)的TiO2納米管陣列，具有很好的生物相容性。目前TiO2納米管陣列已廣泛用于種植體表面處理方面的研究。 近年來(lái)，在鈦種植體表面用陽(yáng)極氧化法形成TiO2納米級(jí)小管作為局部“藥物納米儲(chǔ)存緩釋器”為種植體局部藥物緩釋提供了新思路。TiO2納米管的制備是鈦金屬基片通過(guò)在電解質(zhì)溶液中陽(yáng)極腐蝕而獲得納米級(jí)小管，這種方法可以制得排列整齊的納米管陣列，且納米管與基體金屬直接相連，結(jié)合非常牢固。TiO2納米管具有良好的生物相容性，且其納米管狀結(jié)構(gòu)有利于藥物裝載和緩釋?zhuān)呀?jīng)使用TiO2納米管實(shí)現(xiàn)藥物緩釋17。藥物在TiO2 納米管中的釋放動(dòng)力學(xué)主要受孔結(jié)構(gòu)支配（直徑和長(zhǎng)度比），納米管長(zhǎng)徑比對(duì)于藥物釋放率起著決定性作用，可以有效延遲或加速藥物釋放17。目前延長(zhǎng)藥物釋放的方法主要是減小TiO2 納米管徑，通過(guò)降低藥物釋放率來(lái)延長(zhǎng)釋放持續(xù)時(shí)間，此法存在降低藥物裝載總量、“突釋”現(xiàn)象明顯以及很難以滿(mǎn)足長(zhǎng)時(shí)間（數(shù)周）藥物緩釋的臨床需求等缺點(diǎn)18。 一些學(xué)者用各種方法對(duì)鈦納米管藥物緩釋進(jìn)行調(diào)控。如采用PLGA和殼聚糖對(duì)鈦納米管管口進(jìn)行封閉藥物可以以零級(jí)速率緩釋達(dá)6-8周。還有一些學(xué)者采用電化學(xué)沉積法將羥基磷灰石沉積于鈦納米管管口，大大延緩了藥物的釋放速率。目前這些調(diào)控緩釋的方法僅僅是針對(duì)早期的藥物突釋進(jìn)行調(diào)控，這些緩釋系統(tǒng)不能對(duì)組織的微環(huán)境做出反應(yīng)，不管種植體周?chē)M織是否存在感染，抗菌藥物都按既定的方式進(jìn)行釋放。 在正常生理狀態(tài)下，人體組織環(huán)境處于pH=7.4，某些病理狀態(tài)(如炎癥)下，病灶組織局部由于缺氧導(dǎo)致無(wú)氧代謝而被酸化，pH值降低，在種植體穿齦部位，由于細(xì)菌大量產(chǎn)酸，在菌斑內(nèi)pH值甚至低至5.5。因此，可以將低pH值作為炎癥狀態(tài)的一種典型特點(diǎn)，充分利用炎癥狀態(tài)與正常生理組織環(huán)境下pH值的差異，設(shè)計(jì)一種對(duì)pH響應(yīng)敏感的種植體表面改性體系。 近年來(lái)，生物可降解膠束作為納米藥物載體備受矚目。聚合物膠束是一類(lèi)由兩親性共聚物在水溶液中通過(guò)自組裝形成的納米粒子，親脂性的藥物分子能通過(guò)物理包裹進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，而親水的殼層用來(lái)穩(wěn)定膠束，聚合物膠束具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇（PEG）和聚（-己內(nèi)酯）（PCL）是具有生物可降解性和良好生物相容性的材料，并已獲得FDA批準(zhǔn)由PEG-PCL嵌段共聚物自組裝形成的膠束作為納米藥物載體尤為常見(jiàn)但其存在降解緩慢和無(wú)刺激響應(yīng)性等缺陷，從而阻礙了藥物在靶向部位高效累積，降低了藥物的有效利用率。 目前，已有大量基于酸敏感鍵（原酸酯、腙和縮醛等）的響應(yīng)性膠束的研究。其中，特別是腙鍵，它在中性條件下穩(wěn)定，酸性環(huán)境中容易水解，并被廣泛用于連接聚合物主鏈和各種活性治療藥物在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，腙鍵常被用到pH敏感聚合物膠束中，且能在酸催化下快速水解，其結(jié)構(gòu)合成簡(jiǎn)單，對(duì)酸靈敏度高，最常被用來(lái)作為pH敏感藥物載體的酸可裂解官能團(tuán)。Wang等19報(bào)道了葉酸和細(xì)胞穿透肽R7修飾的含腙鍵PLGA-mPEG膠束，負(fù)載硫酸長(zhǎng)春堿以后，在pH=7.4條件下8 h內(nèi)釋放了35.8%. 而在pH=5.0條件下8h內(nèi)釋放了65.6%.說(shuō)明載藥膠束釋放呈pH依賴(lài)性。因此，充分利用官能團(tuán)腙鍵敏感的pH響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)合PEG-PCL嵌段共聚物良好的生物相容性和生物可降解性，將其共聚物載藥后裝載入鈦表面TiO2納米管內(nèi)，從而可獲得一種具有pH智能響應(yīng)的藥物緩釋體系。參考文獻(xiàn)1 Campoccia D, Montanaro L, Arciola CR. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials 2006, 27(11): 2331-2339.  2 Evan M. Hetrick, Mark H. Schoenfisch. Reducing Implant-Related Infections: Active Release Strategies. Chem Soc Rev 2006,37(48)780-789.3 Dunne WMJr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately Chin Microbiol Rev 2002,15(2):155-166.4 Jahoda D, Nyc O, Pokorny D, et al. Antibiotic treatment for prevention of infectious complications in joint replacement. Acta Chir Orthop Traumatol Cech 2006,73(2):108-114.5 Williams DN, Gustilo RB, Beverly R, et al. Bone and serum concentrations of five cephalosporin drugs. Relevance to prophylaxis and treatment in orthopedic surgery. Clin Orthop relate Res 1983,179:253-265.6 Neut D, Dijkstra RJB, Thompson JI, et al. A gentamicin-releasing coating for cementless hip prostheses Longitudinal evaluation of efficacy using in vitro bio-optical imaging and its wide-spectrum antibacterial efficacy. J Biomed Mater Res A, 2012, 100 (12): 3220-3226. 7 Pichavant L, Amador G, Jacqueline C, et al. pH-controlled delivery of gentamicin sulfate from orthopedic devices preventing nosocomial infections. J Control Release, 2012, 162(2): 373-381.8 Ketonis C, Barr S, Shapiro IM, et al. Antibacterial activity of bone allografts: Comparison of a new vancomycin-tethered allograft with allograft loaded with adsorbed vancomycin. Bone 2011,48(3): 631-638.9 Karan G, Moom SA, David F, et al. Local drug delivery to the bone by drug-releasing implants:perspectives of nano-engineered titania nanotube arrays. Therapeutic Delivery (2012) 3(7), 857873.10梁硯琴. TiO2 納米管的制備及改性研究D. 天津大學(xué),2012.11 Vallet-Regí M. Ordered mesoporous materials in the context of drug delivery systems and bone tissue engineeringJ. Chemistry. 2006 Aug 7;12(23):5934-43.12 Basalious EB, Shamma RN. Novel self-assembled nano-tubular mixed micelles of Pluronics P123, Pluronic F127 and phosphatidylcholine for oral delivery of nimodipine: In vitro characterization, ex vivo transport and in vivo pharmacokinetic studies. Int J Pharm. 2015 Sep 30;493(1-2):347-56.13 M Li ， Y Liu ， L Feng ， F Liu ， L Zhang et al.Polymeric complex micelles with double drug-loading strategies for folate-mediated paclitaxel deliveryJ. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015,131 :191-201.14 S Alejandro ， MR Maya. Polymeric micelles in mucosal drug delivery: Challenges towards clinical translationJ. Biotechnology Advances,2015,33(6 Pt 3):1380.15 Y Cheng ， J Hao ， LA Lee ， MC Biewer ， Q Wang et al.Thermally Controlled Release of Anticancer Drug from Self-Assembled -Substituted Amphiphilic Poly(-caprolactone) Micellar NanoparticlesJ. Biomacromolecules,2012,13(7):2163-2173.16 V. Zwilling, E. Darque-Ceretti, A. Boutry-Forveille, et al. Structure and physicochemistry of anodic oxide films on titanium and TA6V alloy. Surf Interface Anal 1999,27(7):629-637.17 S. P. Albu , A. Ghicov , J. M. Macak ,et al. Self-Organized, Free-Standing TiO2 Nanotube Membrane for Flow-through Photocatalytic Applications. Nano Lett. 2007, 7 (5):1286128918 Vallet-Regí M. Ordered mesoporous materials in the context of drug delivery systems and bone tissue engineeringJ. Chemistry. 2006 Aug 7;12(23):5934-43.19 Wang Y, Dou L M, He H J, Zhang Y, Shen Q. Mol Pharmaceutics, 2014, 11(3): 885-894.3、研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)、擬解決的問(wèn)題和今后研究思路（一）研究?jī)?nèi)容1.微結(jié)構(gòu)的制備：采用陽(yáng)極氧化法在Ti表面制備不同管徑、長(zhǎng)度的TiO2納米管，構(gòu)建PEG-NH-N=CH-PCL聚合物膠束裝載的載體（已部分完成）在含NH4F，H2O 和甘油的電解液中通過(guò)陽(yáng)極氧化法在鈦表面制備TiO2 納米管陣列。對(duì)TiO2 納米管陣列進(jìn)行表征。2.制備PEG-NH-N=CH-PCL聚合物膠束并載藥利用具有生物相容性和生物可降解的PEG和PCL作為原料，采用開(kāi)環(huán)聚合方法，合成PEG-NH-N=CH-PCL嵌段共聚物，并將腙鍵引入到PEG-NH-N=CH-PCL的主鏈上，并以此為構(gòu)筑單元制備共聚物膠束。取一定量的PEG-NH-N=CH-PCL和阿莫西林溶于，-二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲溶解后滴入磷酸鹽緩沖溶液后離心處理，冷凍干燥上層清液得到載藥膠束。采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量聚合物膠束的粒徑及粒徑分布通過(guò)透射電鏡（TEM）觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用核磁共振證實(shí)腙鍵的成功引入，用UV/Vis可見(jiàn)光譜檢測(cè)230nm激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算包封率和載藥量。3.采用真空凍干法裝載聚合物膠束在TiO2納米管內(nèi)裝載已完成藥物包封的PEG-NH-N=CH-PCL膠束。在體外模擬體液中研究PEG-NH-N=CH-PCL膠束的pH智能響應(yīng)性釋放，通過(guò)改變TiO2納米管管徑比，選出能最大程度裝載聚合物膠束的制備參數(shù)。4.生物學(xué)評(píng)價(jià)（1）體外細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)加載了含阿莫西林的pH響應(yīng)型聚合物膠束的TiO2納米管進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)，以及體外模擬炎癥環(huán)境下藥物緩釋對(duì)于種植體周?chē)字谐Ｒ?jiàn)致病菌中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用。（二）研究目標(biāo) 本課題的主要目標(biāo)是成功構(gòu)建一種安全、有效的種植體周pH響應(yīng)型局部緩釋給藥系統(tǒng)，以獲得最大限度裝載阿莫西林及聚合物膠束，充分發(fā)揮聚合物膠束pH智能響應(yīng)型釋放藥物的優(yōu)勢(shì)，模擬種植體周?chē)浊闆r下的低pH 環(huán)境，最大限度的提高藥物利用率，保證種植體的穩(wěn)定性，提高種植成功率。其中包涵以下任務(wù)： （1）成功構(gòu)建一種安全、有效的種植體周局部緩釋給藥系統(tǒng)，獲得TiO2納米管加載聚合物膠束實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)性釋放藥物的效果。 （2）體外模擬試驗(yàn)證實(shí)TiO2納米管加載聚合物膠束pH響應(yīng)型釋放藥物，抑制種植體周?chē)椎陌l(fā)生發(fā)展，提高種植成功率。（三）擬解決的問(wèn)題 如何控制聚合物膠束的粒徑和TiO2納米管管徑及管長(zhǎng)，以期可以達(dá)到最大載藥量和包封率的同時(shí)，保證TiO2納米管的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，是本項(xiàng)目亟需解決的問(wèn)題。（四）今后研究思路 利用本課題的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討種植體周輔助給藥應(yīng)用，進(jìn)一步研制更加“智能”的種植體藥物緩控釋系統(tǒng)，如不需要時(shí)藥物不會(huì)從TiO2 納米管中釋放，而情況需要時(shí)在某種因素刺激下藥物可以按我們?cè)O(shè)定的釋放動(dòng)力學(xué)藥從TiO2 納米管中釋放。并進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)試驗(yàn)研究，為其應(yīng)用于種植臨床奠定基礎(chǔ)。 在完成本課題的研究?jī)?nèi)容后，將申報(bào)浙江省自然科學(xué)基金以獲得資金資助，使研究工作繼續(xù)發(fā)展，推動(dòng)種植體周輔助給藥領(lǐng)域的進(jìn)步。4、研究方法、技術(shù)路線(xiàn)和進(jìn)度安排（一）研究方法陽(yáng)極氧化法法制備TiO2 納米管陣列及表征材料：純鈦片1mm×2mm×0.5mm。電解液：0.50wt% NH4F+ 10vol% H2O 的甘油溶液。 DH1715A-5 型直流穩(wěn)壓電源提供陽(yáng)極氧化所需電源, 在2060V 電壓下陽(yáng)極氧化一定時(shí)間后，立即取出樣品用二次水超聲清洗并晾干。表征：場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SEM）和透射電鏡(TEM)觀察分析試樣表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并利用X 射線(xiàn)能量色散譜( EDS) 分析TiO2 納米管組試樣表面元素組成。開(kāi)環(huán)聚合法制備PEG-NH-N=CH-PCL膠束及表征1.1試劑聚乙二醇（PEG，Mn5000）、對(duì)硝基苯基氯甲酸酯（NPCF）、對(duì)羥基苯甲醛（PHB）、-己內(nèi)酯（-CL）、阿莫西林、吡啶、水合肼、鋅酸亞錫（阿拉試劑公司）；二氯甲烷（CH2Cl2）、二甲基亞砜（DMSO）、，-二甲基甲酰胺（DMF）（北京化工廠）；其他為常用分析純?cè)噭?.2 PEG-NPCF的合成稱(chēng)取PEG（100mg，0.02mmol)溶于20mLCH2Cl2中，用微量進(jìn)樣器向該反應(yīng)體系中加入16.11L吡啶，不斷攪拌直至溶解將mL NPCF（200mg，0.99mmol）的CH2Cl2溶液逐滴加入到反應(yīng)體系中，攪拌24h，控制整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的溫度為反應(yīng)后，濃縮反應(yīng)液并用石油醚、乙酸乙酯沉淀，重復(fù)操作次后，真空干燥至恒重，即得白色固體PEG-NPCF。1.3 PEG-NH-NH2的合成稱(chēng)取PEG-NPCF（100mg，0.02mmol）溶于10mL無(wú)水乙醇，將29.10L水合肼逐滴滴加到反應(yīng)體系中，90回流攪拌48h冷卻至室溫后，濃縮反應(yīng)液，加入石油醚、乙酸乙酯，使沉淀析出，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，重復(fù)操作次后，真空干燥即得淡黃色固體PEG-NH-NH2。1.4 PEG-NH-N=CH-OH的合成稱(chēng)取PEG-NH-NH2（200mg，0.04mmol），PHB（20mg，0.016mmol）置于Schlenk瓶中，用mL的DMSO溶解，加入滴無(wú)水乙酸，抽真空充氮?dú)庋h(huán)次，密封Schlenk瓶，于65攪拌反應(yīng)用石油醚、乙酸乙酯沉淀，過(guò)濾，重復(fù)操作次后，真空干燥即得白色固體1.5 PEG-NH-N=CH-PCL的合成在Schlenk瓶中，將PEG-NH-N=CH-OH（100mg，0.02mmol），-CL（130mg，1.14mmol），鋅酸亞錫（20.25mg，0.05mmol）溶于5mL甲苯中，抽真空充氮?dú)庋h(huán)次，于110攪拌反應(yīng)24h冷卻至室溫后，加入適量氯仿使反應(yīng)物完全溶解，用冷乙醚沉淀，過(guò)濾，真空干燥即得淡黃色固體PEG-NH-N=CH-PCL。1.6聚合物膠束的自組裝將10mg聚合物加入到1mlDMF中，超聲直至溶解，然后逐滴滴加（滴/15s）10ml蒸餾水，室溫?cái)嚢?4h后即得穩(wěn)定的聚合物膠束取5mL膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（MWCO3000）中，用蒸餾水透析48h，即得空白聚合物膠束。37條件下，采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量聚合物膠束的粒徑及粒徑分布通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察聚合物膠束的形態(tài)結(jié)構(gòu)將透析得到的聚合物膠束滴在銅網(wǎng)表面，放在紅外燈下，待干燥后，采用TEM檢測(cè)，加速電壓為200kV。1.7載藥膠束的制備與體外釋放將5mg PEG-NH-N=CH-PCL和2mg阿莫西林溶于0.5mL DMF中，超聲直至溶解，然后向溶液中逐滴滴加(1滴/15s)5mL磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4），室溫下攪拌24h將載藥膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（MWCO30000）中，在磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4）中透析48h，在12000r/min下離心15min，冷凍干燥上層清液得到載藥膠束，整個(gè)過(guò)程在避光條件下進(jìn)行配制不同濃度的阿莫西林溶液，在37下，用UV/Vis可見(jiàn)光譜檢測(cè)230nm激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為了測(cè)量載藥量，將凍干的載藥膠束溶于DMF中，檢測(cè)其在230nm處的吸光度值，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程中，包封率和載藥量的計(jì)算公式如下：包封率=（負(fù)載到膠束中阿莫西林的質(zhì)量/投入藥質(zhì)量）×100%載藥量=（負(fù)載到膠束中阿莫西林的質(zhì)量/載藥膠束質(zhì)量）×100%真空凍干法加載PEG-NH-N=CH-PCL膠束至TiO2納米管及表征 用PBS溶液將PEG-NH-N=CH-PCL膠束配制成0.5mg/mL的溶液。在清洗并干燥完成的二氧化鈦納米管表面加載PEG-NH-N=CH-PCL膠束。每次在二氧化鈦納米管表面移液管滴加10L PEG-NH-N=CH-PCL膠束溶液，盡量鋪勻整個(gè)表面。然后將試樣放入凍干機(jī)中，在溫度設(shè)定為室溫，抽真空，干燥2h。重復(fù)上述加載步驟，直到每片試樣加載到100ug(A組，n=5) 或每片加載到200 ug (B組，n=5)。在最后一次加載蛋白干燥后，每一試樣用移液管吸取500L PBS 快速?zèng)_洗表面，移除未與納米管牢固結(jié)合多余的BSA。收集沖洗液，保存用于后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。加載量D1，沖洗下來(lái)的量是D2，那么加載效率為: =(D1-D2)/D1。體外模擬炎癥狀態(tài)下阿莫西林釋放測(cè)試 將試樣放入24孔板中，500L SBF 中浸泡，分兩組，分別為pH7.4和5.5，置于每分鐘70轉(zhuǎn)的搖床上，在一定時(shí)間間隔內(nèi)（1h、3h、5h、10h、24h、3d、5d、7d、10d、20d、30d、40d、50d）收集200L液體備用，再加入新鮮的200L SBF 。收集的液體用ELISA法檢測(cè)濃度，計(jì)算釋放的劑量，繪制釋放曲線(xiàn)。 抗菌性能檢測(cè) 將載有含阿莫西林的聚合物膠束組、對(duì)照組（僅裝載阿莫西林）、空白對(duì)照組（不裝載藥物）的鈦片裁成1mm×1mm 大小，每組個(gè)三個(gè)樣本，滅菌放置，備用。再將金黃色葡萄球菌接種于三組材料表面培養(yǎng)24小時(shí)，將洗脫液于瓊脂平板上均勻推開(kāi)，需氧培養(yǎng)24小時(shí)后平板計(jì)數(shù)?？咕?(對(duì)照組菌落數(shù)cfu-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)cfu)/對(duì)照組菌落數(shù)cfu×100%（二）技術(shù)路線(xiàn)純鈦片 陽(yáng)極氧化TiO2納米管陣列PEG-NH-N=CH-PCL膠束真空凍干法載藥TiO2納米管陣列 采用對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行抗菌性能檢測(cè)在體外模擬體液中研究阿莫西林的pH響應(yīng)型釋放動(dòng)力學(xué)（三）進(jìn)度安排第一年度（2018.1-2018.12）：1. 資料收集，調(diào)研、課題設(shè)計(jì)完善；2TiO2納米管陣列制備及檢測(cè)3.pH響應(yīng)型PEG-NH-N=CH-PCL膠束制備及其表征第二年度（2019.1-2019.12）：1.完成TiO2納米管內(nèi)PEG-NH-N=CH-PCL膠束裝載2. TiO2納米管負(fù)載PEG-NH-N=CH-PCL膠束性能檢測(cè)3.載阿莫西林聚合物膠束的緩釋動(dòng)力學(xué)研究及其調(diào)控第三年度（2020.1-2020.12）： 1.細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)及抗菌性能檢測(cè) 2.結(jié)果分析，綜合評(píng)價(jià)，課題結(jié)題，成果鑒定5、主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)本課題針對(duì)目前鈦種植體表面抗菌藥物緩釋存在的問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一種新型的智能藥物緩釋系統(tǒng)，利用炎癥和正常組織的PH差異，實(shí)現(xiàn)種植體微環(huán)境對(duì)抗菌藥物釋放的智能調(diào)控；改變了目前鈦種植體表面藥物緩釋系統(tǒng)僅僅按照既定程序釋放而不能對(duì)組織微環(huán)境作出相應(yīng)響應(yīng)的缺點(diǎn)，提高抗菌效率。在鈦納米管表面實(shí)現(xiàn)PH響應(yīng)的藥物緩釋系統(tǒng)，為種植體體表面生化修飾和藥物緩釋提供了新思路。6、項(xiàng)目預(yù)期成果、考核指標(biāo)1.成功將腙鍵引入到兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL的主鏈上，實(shí)現(xiàn)聚合物的pH響應(yīng)特性，制備載藥膠束。2明確載藥膠束最大程度的裝載入TiO2納米管內(nèi)，并實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)型藥物緩釋。3.鈦種植體均具有良好的生物相容性，不影響鈦種植體表面的生物礦化和細(xì)胞活力。4.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在炎癥狀態(tài)下ph響應(yīng)藥物緩釋系統(tǒng)有更好的抗菌效果，更有利于炎癥狀態(tài)下，種植體周?chē)墙Y(jié)合。5.在國(guó)內(nèi)外核心期刊上發(fā)表論文2篇，其中SCI源刊文章1篇，申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利1項(xiàng)。7、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)和條件(1)課題組人員組成及實(shí)驗(yàn)室條件 項(xiàng)目申請(qǐng)者長(zhǎng)期從事口腔相關(guān)生物材料研究，已經(jīng)在Carbonhydrate Polymers(IF=3.628), International Journal of Molecular Sciences（IF=2.453), Advanced Materials Research，中國(guó)組織工程醫(yī)學(xué)研究、口腔醫(yī)學(xué)研究發(fā)表文章數(shù)篇，其中以第一作者發(fā)表SCI論文3篇，以通訊作者發(fā)表EI論文1篇，具有一定的生物材料研究經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目組成員均具有生物材料研究經(jīng)驗(yàn)，發(fā)表多篇論文。 申請(qǐng)者所在口腔材料研究所一貫強(qiáng)調(diào)口腔醫(yī)學(xué)特色，以牙頜面修復(fù)重建為研究主線(xiàn)，開(kāi)展生物材料研制和評(píng)價(jià)，先后承擔(dān)國(guó)家、部省級(jí)課題多項(xiàng)。本課題組前期研究為本項(xiàng)目鈦表面改性材料制備進(jìn)行了系統(tǒng)的工作。所在單位設(shè)備齊全，測(cè)試手段完整，已有設(shè)備包括掃描電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、原子力顯微鏡、X射線(xiàn)光電子能譜分析、冷凍干燥設(shè)備、真空干燥設(shè)備、恒壓穩(wěn)壓電、百級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)凈化室，細(xì)胞及分子生物學(xué)研究工作所需的設(shè)備和儀器，如：細(xì)胞活力儀、流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、低溫離心機(jī)、激光共聚焦顯微鏡、Micro-CT儀等較為齊全的研究手段和設(shè)備。具備以上條件將給本項(xiàng)目的實(shí)施及計(jì)劃落實(shí)提供可靠保證。另外，本研究所需的試劑和原料（包括國(guó)外公司產(chǎn)品）均可在國(guó)內(nèi)購(gòu)得，實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞株、標(biāo)準(zhǔn)菌株本課題組實(shí)驗(yàn)室均具備。綜上，本項(xiàng)目所開(kāi)展的工作在理論上、研究的內(nèi)容和技術(shù)手段、研究人員的前期工作基礎(chǔ)、目前的實(shí)驗(yàn)室條件評(píng)價(jià)可行，并有望達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。發(fā)表的相關(guān)論文：1.Preparation and Characterization of Lanthanum-Incorporated Hydroxyapatite Coatings on Titanium Substrates.International Jouranl of Molecular Sciences.2015.16.21070-210862.In vivo evaluation of in situ polysaccharide based hydrogel for prevention of postoperative adhesion. Carbohydrate Polymers,2012,90(2):1024-1031.3.Sol-Gel-Derived Hydroxyapatite-Carbon Nanotube/Titania Coatings on Titanium Substrates. International Journal of Molecular Sciences，2012,13(4):5242-5253.4. Effects of Shaking Frequency on Growth and Adhesion Behaviour of Streptococcus Mutans,2013,749:p206-2105. Hierarchical structure and mechanical properties of remineralized dentin. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2014, 40, 297-306.6. Biomimetic promotion of dentin remineralization using L-glutamic acid: inspiration from biomineralization proteins, JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B,2014, 2: (28): 4544-45537. Prosthodontic Rehabilitation of Malpositioned Implants After Ameloblastoma Followed by Mandibulectomy and Costal Bone Graft: A Clinical Report, Implant Dentistry,2013,22 (1):16-198. Bio-inspired enamel repair via Glu-directed assembly of apatite nanoparticles: an approach to biomaterials with optimal characteristics. Adv Mater 2011, 23 (40), 4695-4701.9. Does endodontic post space irrigation affect smear layer removal and bonding effectiveness EUROPEAN JOURNAL OF ORAL SCIENCES, 2009,117 (5), 597-60310. Effect of Different Irrigation on Smear Layer Removal after Post Space Preparation, JOURNAL OF ENDODONTICS, 2009 35 (4),583-58611. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks,JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY, 2011, 18 (34), 4079-408412. Glutaraldehyde-induced remineralization improves the mechanical properties and biostability of dentin collagen.Materials Science and Engineering C，67 (2016) 657665(2) 課題組前期相關(guān)的研究成果 本課題組前期利用陽(yáng)級(jí)氧化法成功地在Ti表面制備了TiO2納米管陣列，通過(guò)控制反應(yīng)條件可控制形成的TiO2直徑在20-300nm之間，為裝載聚合物膠束奠定了基礎(chǔ)。圖一 不同電壓下制備TiO2納米管陣列表面形貌SEM圖（10.0kv ×30,000）(a)80V (b)60V (c)40V (d)30V圖二 經(jīng)450退火處理的TiO2納米管陣列EDS圖譜 上圖是iO2納米管陣列的EDS圖譜，只檢測(cè)到Ti、O元素，且峰值明顯。元素定量分析結(jié)果表明，樣品中含有Ti、O所占的原子百分比分別為33.79、66.211：2，表明樣品以TiO2形式存在為主。圖三 載阿莫西林TiO2納米管陣列XRD圖譜圖四 阿莫西林體外釋放曲線(xiàn)8、經(jīng)費(fèi)預(yù)算與說(shuō)明開(kāi)支科目專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（萬(wàn)元）配套經(jīng)費(fèi)（萬(wàn)元）預(yù)算說(shuō)明設(shè)備費(fèi)0.000.00無(wú)材料費(fèi)1.01.15購(gòu)買(mǎi)鈦片、試劑、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料試驗(yàn)化驗(yàn)加工費(fèi)1.01.0場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SEM）、透射電鏡(TEM)，并利用X射線(xiàn)能量色散譜( EDS) 、接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量接觸角、原子力顯微鏡(AFM)、X射線(xiàn)電子能譜儀(XPS)燃料動(dòng)力費(fèi)0.000.00無(wú)管理費(fèi)0.150.00按相關(guān)規(guī)定提取會(huì)議費(fèi)0.000.00無(wú)差旅費(fèi)0.350.35參加學(xué)術(shù)交流以及到其他科研機(jī)構(gòu)科學(xué)咨詢(xún)的差旅費(fèi)出版/文獻(xiàn)/信息傳播/知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)費(fèi)0.30.3文章出版費(fèi)及文獻(xiàn)檢索費(fèi)用合作、協(xié)作研究與交流費(fèi)0.20.2參加口腔生物材料會(huì)專(zhuān)家咨詢(xún)費(fèi)0.000.00無(wú)人員勞務(wù)費(fèi)0.000.00無(wú)外撥費(fèi)用0.000.00無(wú)其他開(kāi)支0.000.00無(wú)-可編輯修改-