病理學(xué)技術(shù)概論 及常規(guī)病理技術(shù),南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系 申 洪,課程簡介,內(nèi)容：著重介紹重要的病理學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用 目的：提供病理學(xué)研究所需的基本技術(shù)知識(shí) 體系和病理學(xué)研究的一些基本思路；,課程結(jié)構(gòu)：,常規(guī)病理學(xué)技術(shù) 細(xì)胞病理學(xué)技術(shù)及其在腫瘤病理學(xué)中的應(yīng)用 電鏡技術(shù)及其在病理學(xué)中的應(yīng)用 定量病理學(xué)技術(shù)及其在病理學(xué)中的應(yīng)用,基本要求,基本概念 基本原理 基本方法和技術(shù)關(guān)鍵 聯(lián)系實(shí)際，思考應(yīng)用,一、病理學(xué)技術(shù)概念范疇,1 病理學(xué) 2 病理學(xué)技術(shù) 廣義概念 狹義概念：圍繞病理形態(tài)學(xué),病理形態(tài)學(xué)技術(shù)類型, 尸體剖驗(yàn)技術(shù) 常規(guī)組織病理學(xué)技術(shù) 常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)技術(shù) 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫組織化學(xué)技術(shù) 流式細(xì)胞技術(shù) 超微結(jié)構(gòu)技術(shù) 體視學(xué)技術(shù)： 定量病理學(xué)技術(shù) 圖像分析技術(shù) 分子病理學(xué)技術(shù) 激光共聚焦顯微鏡 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù) 三維重建技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),一、尸體剖驗(yàn)技術(shù),目的意義：查出病因和病變，明確診斷及死因 解釋臨床癥狀和體征等臨床現(xiàn)象 及時(shí)發(fā)現(xiàn)和確診新疾病，特別是傳染病 提供第一手科研材料 法律手續(xù)：死者家屬簽字 臨床醫(yī)生簽字 單位簽字 基本要求：研究生：參加病理解剖 本科生：見習(xí),二 常規(guī)病理學(xué)技術(shù),組織取材及固定技術(shù) 包埋 石蠟切片技術(shù) 冰凍切片技術(shù) HE染色,標(biāo)本的來源與收集 1、臨床活檢 2、尸體解剖 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 注意事項(xiàng) 1、檢查申請(qǐng)單的姓名，標(biāo)本的件數(shù)是否與之相符合。 2、標(biāo)本是否符合要求。,（一）取材、固定,標(biāo)本的來源與收集 1、臨床活檢 2、尸體解剖 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 注意事項(xiàng) 1、檢查申請(qǐng)單的姓名及標(biāo)本件數(shù)是否相符。 2、標(biāo)本是否符合要求。,取材：,切取病變組織或擬研究的組織 及時(shí)，盡可能新鮮 迅速固定、冷藏 生理鹽水、磷酸緩沖液等溶液 刀要快，不要擠壓組織 注意研究目的 培養(yǎng) 定量 對(duì)比觀察 臨床診斷,固 定,（一）固定：用化學(xué)試劑保持尸體、器官、組 織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的固有形態(tài)結(jié) 構(gòu)的過程謂固定，所用的化學(xué)試 劑謂固定劑或固定液。 目的：防止自溶、腐敗，保持良好結(jié)構(gòu) 原理：組織及細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，或使有 關(guān)成分沉淀、變性，成為不溶性 物質(zhì)。 方法：浸泡 灌注：局部灌注、全身灌注 蒸汽熏蒸,固定時(shí)間: 常規(guī)組織病理學(xué): 可長時(shí)間固定 細(xì)胞病理學(xué)：可長時(shí)間固定 細(xì)胞化學(xué)：不宜過長，約1小時(shí)為宜 固定后處理： 充分洗滌 固定時(shí)間越長，洗滌時(shí)間也應(yīng)相應(yīng)增加,固定注意事項(xiàng),1. 固定液有毒性，注意自身防護(hù) 2. 及時(shí)，盡可能新鮮 3. 超微結(jié)構(gòu)觀察：低溫固定 4. 注意不同研究目的對(duì)固定液的特殊需要 細(xì)胞化學(xué) 超微結(jié)構(gòu) 細(xì)胞涂片巴氏染色 5. 固定液用量：足，必要時(shí)及時(shí)更換。 6. 固定時(shí)間 7. 固定后洗滌,常用固定液,甲醛溶液：4甲醛，或 10福爾馬林 40甲醛（福爾馬林，F(xiàn)ormeldehyde） 用于無特要求的組織常規(guī)固定 乙醇（Ethyl Alcohol）: 95% 用于細(xì)胞病理學(xué)涂片常規(guī)固定，糖原固定 乙醇乙醚混合固定液: 95% ： 95%乙醇+ 95%乙醚（1:1） 用于細(xì)胞涂片巴氏染色,（二）石蠟包埋制樣,組織塊脫水： 逐級(jí)乙醇脫水 透明：二甲苯 浸蠟：65C 包埋：溶解蠟,人工脫水程序 (適應(yīng)于3mm厚的組織塊),1、30%酒精 24h 2、50%酒精 24h 3、70%酒精 24h 4、80%酒精 24h 5、90%酒精 12h 6、95%酒精 4h 7、95%酒精 4h,8、100%酒精 2h 9、100%酒精 2h 10 二甲苯 40min 11 二甲苯 40min 12 石蠟（軟） 1h 13 石蠟 1h 14 石蠟 1h,（三）石蠟切片,(四) HE染色：蘇木素伊紅染色,1 脫蠟 （二甲苯） 2 水化 （逐級(jí)乙醇水化：10030） 3 染蘇木素 4 1鹽酸酒精分化 返蘭 逐級(jí)乙醇脫水 30 (或50) 95 伊紅染色 逐級(jí)乙醇脫水 （95100） 二甲苯透明 封片：中性樹膠蓋玻片,HE染色法程序,三、常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)技術(shù), 細(xì)胞病理學(xué)（cytopathology） 診斷細(xì)胞學(xué)（diagnostic cytology） 臨床細(xì)胞學(xué)（clinical cytology）。 該學(xué)科是利用身體器官組織正?；虿∽兊碾x體細(xì)胞進(jìn)行涂片，經(jīng)顯微鏡觀察，做出疾病診斷，特別是腫瘤良惡性診斷. 細(xì)胞病理學(xué)方法簡便易行、診斷準(zhǔn)確、可靠，已成為癌癥早期診斷的重要手段之一，可廣泛應(yīng)用于臨床和大量人群防癌普查。,三、常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)技術(shù), 一、取材、涂片制備 痰涂片、胸水、腹水及尿液制片 二、固定 三、染色 (巴氏染色),常用固定液,（1）等量95%乙醇和乙醚混合液 （2）氯仿酒精固定液 （3）95%酒精固定液 （4）福爾馬林固定液 細(xì)胞學(xué)研究，固定液選擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求條件而定，如用細(xì)胞涂片作原位PCR，固定液要選用多聚甲醛。,巴氏染色步驟,1標(biāo)本95酒精固定3-5分鐘 2Harris蘇木素液5-10分鐘 3水（蒸餾水或自來水）漂洗2-3次 41鹽酸水溶液（或1鹽酸酒精液） 浸1-3次 5自來水浸洗1-2次 6自來水或稀碳酸鋰（100ml蒸餾水中加碳酸鋰飽和液1滴），涂片返藍(lán)為止,7依次置入708095酒精， 各2分鐘 8桔黃G6液，1分鐘 995酒精、缸，各1分鐘 10EA36液，5分鐘 1195酒精、，各1分鐘 12無水酒精、，各1分鐘 13二甲苯、，各2分鐘 14中性樹膠蓋片封固,四、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù),用化學(xué)反應(yīng)原理，在切片上滴加某種化學(xué)試劑，使之與組織或細(xì)胞中的生物化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，再用顯色劑使之顯色，達(dá)到定位、定性地顯示組織或細(xì)胞中的某種物質(zhì)成分，這種技術(shù)稱為組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。其結(jié)果可用顯微鏡和電鏡觀察。結(jié)合定量病理學(xué)技術(shù)，還可對(duì)有關(guān)成分定量。,應(yīng) 用, 糖類 脂類 核酸 酶類 膠原纖維 彈力纖維 神經(jīng)纖維 細(xì)胞膜、核膜結(jié)構(gòu),五、免疫組織化學(xué)技術(shù),概念：免疫組織化學(xué)技術(shù)是指利用已知的抗 體與組織中相應(yīng)的抗原結(jié)合，并利用 顯色劑在原位將抗原物質(zhì)顯示出來 原理：抗原抗體顯色劑 特點(diǎn)：在組織中原位顯示某種特異性抗原 常用顯色劑種類：酶、金屬粒子、同位素 生物素、化學(xué)顯色劑（DAB） 結(jié)果觀察：顯微鏡、透射電鏡,六、超微結(jié)構(gòu)的基本技術(shù),超微結(jié)構(gòu)是在高分辨條件下觀察到的細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁、核膜、各種細(xì)胞器、微絨毛、纖毛、細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)及膠原纖維、彈力纖維等光鏡水平觀察不到的細(xì)微結(jié)構(gòu)。,（一）透射電鏡技術(shù),1. 取材：11mm3 2. 固定: 2%戊二醛 2h 1%鋨酸 12h 3. 脫水：逐級(jí)丙酮，環(huán)氧丙烷 4. 包埋及聚合：浸透、包埋（Epon812） 聚合（硬化）、時(shí)間 5. 超薄切片：超薄切片機(jī) 6. 染色：飽和醋酸鈾、1檸檬酸鉛 7. 透射電鏡觀察,（二）掃描電鏡技術(shù),1. 取材：11mm3 2. 固定: 2%戊二醛 2h 1%鋨酸 12h 3. 脫水：逐級(jí)丙酮，環(huán)氧丙烷 4. 干燥：臨界點(diǎn)干燥，醋酸異戊酯 5. 噴金： 6. 掃描電鏡觀察,七、定量病理學(xué)技術(shù), 體視學(xué) (Stereology)： 二維結(jié)構(gòu)信息定量推論三維結(jié)構(gòu)信息 研究內(nèi)容： 二維定量推論三維的原理、方法及應(yīng)用，圖像分析原理和方法 生物體視學(xué) (Biological Stereology) 用體視學(xué)原理和方法研究生物組織的三維結(jié)構(gòu)，并據(jù)生物組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究相應(yīng)的體視學(xué)測(cè)試方法稱為生物體視學(xué),形態(tài)測(cè)量學(xué)（Morphometry） 平面測(cè)量學(xué)（Planimetry） 體視學(xué)(Stereology) 形態(tài)結(jié)構(gòu)要素計(jì)數(shù)，如核分裂計(jì)數(shù) 顯微分光光度術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 激光共聚焦顯微圖像分析 圖像分析,特 點(diǎn),給出量化結(jié)果 提高結(jié)果表達(dá)的客觀性和準(zhǔn)確性,應(yīng) 用, 診斷 預(yù)后分析 基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 三維結(jié)構(gòu)定量分析 形態(tài)與機(jī)能有機(jī)結(jié)合,八、分子病理學(xué)技術(shù), 廣義概念： 狹義概念：將分子生物學(xué)方法與病理形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從分子生物學(xué)水平原位闡明病變的特點(diǎn)和規(guī)律謂分子病理學(xué)技術(shù)。 原位PCR技術(shù) 原位雜交技術(shù) 顯微切割技術(shù),九、其他病理學(xué)技術(shù), 細(xì)胞及組織培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞及細(xì)胞器分離技術(shù) 顯微切割技術(shù) 顯微攝影技術(shù) 核仁組成區(qū)技術(shù) 熒光染色技術(shù) 核移植技術(shù) 酶組織化學(xué)技術(shù) 放射自顯影技術(shù) 流式細(xì)胞技術(shù) 激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù),附: 常規(guī)病理學(xué)技術(shù)詳解,一、標(biāo)本的來源與收集 (一) 1、臨床活檢 2、尸體解剖 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 （二） 1、檢查申請(qǐng)單的姓名，標(biāo)本的件數(shù)是否與之相符合。 2、標(biāo)本是否符合要求。,二、標(biāo)本的處理 1、對(duì)送檢物進(jìn)行編號(hào)登記，以免混亂。 2、小組織全部包埋。 3、大塊組織切取其中部分組織，如腫瘤和腫瘤邊緣組織，剩余組織在病理報(bào)告發(fā)出后約一個(gè)星期后處理。,三、組織的固定 將取好的組織放入固定液進(jìn)行固定，活檢組織的固定，由于受到時(shí)間的限制，不能過多的占用時(shí)間，最多只能占2小時(shí)，其它的組織可固定10-20小時(shí)，但最好不要超過24小時(shí)，因這個(gè)時(shí)間對(duì)以后的免疫組化的顯示都有影響。,四、固定的作用 固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或減少外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)，防止細(xì)胞自溶，以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的是保存組織或細(xì)胞的抗原性，不但使抗原不致失活，還要使抗原不發(fā)生彌散，以免在免疫組化染色時(shí)產(chǎn)生過深的背景。,五、固定的目的 1、能防止細(xì)菌的腐蝕和抑制組織的自溶 2、能凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液的蛋白等 3、使組織硬化，便于切塊 4、對(duì)某些具有傳染性的標(biāo)本，能防止其擴(kuò)散 5、保存組織細(xì)胞中固有的物質(zhì) 6、保存好大體標(biāo)本 7、可增強(qiáng)染色,六、固定時(shí)的注意事項(xiàng) 1、組織塊越新鮮越好 2、組織塊不宜過厚過大 3、根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?4、組織固定時(shí)間不宜過長，也不能太短 5、固定液的量要充分，1：5 6、不應(yīng)強(qiáng)行將組織裝入較小的容器內(nèi) 7、特殊方法需要特殊的固定液,七、固定液的選擇 1、盡量選擇對(duì)組織收縮少，滲透快的固定液 2、選擇較通用的固定液，既能做好HE的染色，又能做免疫組化標(biāo)記 3、特殊的病例選擇特殊的固定液 如： 狂犬病丙酮 磷酸酶丙酮 糖原無水酒精,八、固定液的分類 .醛類：甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等 .氧化劑類：四氧化餓（奧酸）、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等 .蛋白變性類：醋酸、甲醇、乙醇等 .其它：氯化汞，苦味酸等。,九、固定液的使用 （一）甲醛（formaldehyde） 一般市售的含37-40%，平時(shí)使用都把它看為100%。它由甲醛氣體飽和于水而成。比重為1.12，有一股刺鼻的氣味。甲醛與組織蛋白質(zhì)類的反應(yīng)是多樣而復(fù)雜的，因?yàn)樗芎投喾N不同的功能基團(tuán)結(jié)合。如近來的抗原修復(fù)就是認(rèn)為組織中的蛋白與醛產(chǎn)生交聯(lián)蛋白后，要將它們顯示出來，就必須應(yīng)用溫度高達(dá)92以上的抗原修復(fù)液，才能將其交聯(lián)的醛鍵打開，與后來的抗體結(jié)合，將其表達(dá)出來。,甲醛的優(yōu)點(diǎn)： 1、收縮較小 2、固定較為均勻，穿透力強(qiáng) 3、能使組織硬化并富有彈性 4、能保存脂肪及脂類物質(zhì) 5、成本較低,甲醛的缺點(diǎn)： 1、成分不純，含少量的甲醇，影響酶反應(yīng) 2、含少量的甲酸，易產(chǎn)生色素 3、不能固定尿酸和糖類物質(zhì) 4、易揮發(fā)、污染環(huán)境 5、易產(chǎn)生醛基、封閉抗原,應(yīng)用甲醛配成的固定液有： 1、緩沖福爾馬林固定液（neutral buffered formaaldehyde） NaH2PO4H2O 4g Na2HPO4（無水） 65g 蒸餾水 900ml 甲醛 100ml,2、10%福爾馬林固定液 甲醛 10ml 自來水 90ml 3、10%福爾馬林鹽固定液 甲醛 10ml 自來水 90ml NaCl 0.9g,4、Bouin氏固定液 苦味酸飽和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml,5、Zonker氏液 氯化汞 5g 重鉻酸鉀 2.5g 硫酸鈉 1g 水 100ml 注：該固定液固定時(shí)間為16-24h，染色前應(yīng)用碘酒除去汞鹽的沉淀，否則會(huì)影響染色后切片的觀察。,（二）酒精（alcohol） 有無水酒精（99.8%）和工業(yè)酒精（95%）在病理技術(shù)方面，酒精是一種重要的試劑，它可配成不同的濃度來進(jìn)行脫水，如：60%、70%、80%、90%、95%等，在切片染色前，用酒精來除去二甲苯，在染完色后則用其來脫水。,應(yīng)當(dāng)注意的是，組織脫水時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的大小、器官或部位、取材的大小來確定脫水時(shí)間，一般認(rèn)為濃度越低，脫水時(shí)間可以相對(duì)延長，如70%可用來長期保存標(biāo)本，但如果在100%的酒精里時(shí)間就不能太長，否則組織易脆不利于切片。酒精可以與其它試劑混合，配成混合固定液，如AAF固定液。,酒精的優(yōu)點(diǎn)： 1、可以保存糖原和尿酸結(jié)晶。 2、能在任何比例的情況下與水混合。 3、能溶解苯類物質(zhì)，為染色法中的橋梁試劑。 4、能脫去切片上的水份。 5、可配成混合固定液。 6 、可作為保存標(biāo)本的固定液。 7 、可用來消毒。,灑精的缺點(diǎn)： 1、可溶解脂類及脂肪物質(zhì)。 2、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。 3、滲透力不強(qiáng)。 4、可脫去某些已著染切片的顏色。 5、不作為單獨(dú)的固定液。 6、價(jià)格昂貴。,病理組織切片的制作,一、石蠟切片 （一）組織脫水 人體或各種動(dòng)物的各種組織，都含有大量的水分。在石蠟切片中，水與蠟不能相混合，必須想辦法將含于組織中的水分脫去，才能完成一系列的操作過程，制作好的切片。,1、人工脫水法優(yōu)點(diǎn)： （1）可根椐不同的組織選擇最佳時(shí)間。 （2）可避免細(xì)小的組織經(jīng)受不必要的脫水時(shí)間,防止組織的硬脆 （）可靈活掌握，隨時(shí)進(jìn)行觀察和調(diào)整,2、人工脫水法的不是之處： （1）需耗人力； （2）必須在白天完成，晚上無法進(jìn)行換液； （3）如機(jī)器發(fā)生故障，組織塊被擱置在外邊，致使組織干涸，影響了制片的質(zhì)量。,人工脫水程序 (適應(yīng)于3mm厚的組織塊),1、80%酒精 24h 2、90%酒精 12h 3、95%酒精 4h 4、95%酒精 4h 5、100%酒精 2h 6、100%酒精 2h,7、二甲苯 40min 8、二甲苯 40min 9、石蠟（軟） 1h 10、石蠟 1h 11、石蠟 1h,細(xì)小組織脫水程序 （適合于胃、腸鏡活檢，肝、肺、腎穿刺活檢的組織） 1、80%酒精10-15min 2、90%酒精10-15min 3、95%酒精10-15min 4、100%酒精10-15min 5、二甲苯5-10min 6、石蠟15-20min,Shandan全封閉電腦控制全自動(dòng)組織脫水機(jī) 該機(jī)由電腦、反應(yīng)缸和試劑儲(chǔ)存缸三部分構(gòu)成。 電腦屏幕可顯示時(shí)間、溫度、所需時(shí)間、是否用真空負(fù)壓等，可根據(jù)不同的時(shí)間要求，編制9套不同的組織脫水程序。,1、正常室溫脫水程序 A、10%福爾馬林 2h B、90%酒精 1.5h C、95%酒精 1.5h D、95%酒精 1h E、95%酒精 1h F、100%酒精 1h,G、100%酒精1h H、100%酒精1h I、二甲苯40min J、二甲苯40min K、石蠟65真空負(fù)壓1h L、石蠟65真空負(fù)壓1h,2、加溫脫水程序 應(yīng)用正常室溫的脫水時(shí)間，再編入加溫程序，加溫的溫度一般在37-40 3、真空負(fù)壓脫水程序 應(yīng)用正常室溫的脫水時(shí)間，再編入真空負(fù)壓脫水程序,4、周末程序,A、10%福爾馬林10h B、90%酒精10h C、95%酒精10h D、95%酒精10h E、95%酒精10h F、100%酒精2h,G、100%酒精2h H、100%酒精2h I、二甲苯1h J、二甲苯1h K、石蠟65真空負(fù)壓1h L、石蠟65真空負(fù)壓1h,該機(jī)的特點(diǎn)： 1、容量大，一次可處理250-300個(gè)包埋盒。 2、全部密閉，試劑不易揮發(fā)，保護(hù)了環(huán)境。 3、帶有定期的攪動(dòng)裝置，使組織固定均勻，脫水徹底，浸蠟充分。 4、脫水過程可使用真空負(fù)壓和加熱。 5、該機(jī)占地量小。,組織透明 應(yīng)用于透明組織的試劑有很多種，有：二甲苯，三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯酚，松節(jié)油等。,二甲苯的主要性能和使用 它是一種透明無色的液體，揮發(fā)性強(qiáng)，打開后即可聞到它的味道。它可溶于灑精，丙酮等含醇類的物質(zhì)，也可溶解石蠟，但不溶于水。當(dāng)脫完水的組織放入二甲苯后，經(jīng)過一定的時(shí)間組織即可透明，如果組織四周透明，中間留有白點(diǎn)，則說明中間部分沒有徹底脫水，此時(shí)應(yīng)將組織重新放回灑精脫水。但經(jīng)這樣處理后的組織切片效果較差。,（二）組織浸蠟 將透明的組織移放入65左右的電熱恒溫箱或脫水機(jī)上的特設(shè)蠟缸中，浸漬一定的時(shí)間，這個(gè)過程稱為浸蠟。,1、可起到填充、支撐的作用。 組織經(jīng)酒精、二甲苯的作用后，其中有許多物質(zhì)被溶解去，如脂肪及脂類物質(zhì)、糖原等。因而遺留下許多腔隙，妨礙了切片。在切片時(shí)由于誘導(dǎo)劑的作用下石蠟可以浸入到物質(zhì)的各個(gè)角落，當(dāng)石蠟冷卻時(shí)，浸入到各處的石蠟就填充在各處的空隙，包括血管和器官等。使組織保持原有的形狀，也使包埋后蠟塊保持平整，便于切片。,2、使切片能完整的切除并保持切片的美觀 3、石蠟的使用 （1）石蠟的性質(zhì) 它是一種碳?xì)浠衔?，熔點(diǎn)45-70以上。,（2）石蠟熔點(diǎn)的種類 45 52-54 54-56 56-58 58-60 60-62,（3）石蠟性質(zhì)的改善 增加石蠟的硬度，如加入脂蠟酸、柏油、楊梅蠟等。 增加石蠟的粘度，如加入蜂蠟、硬脂肪等。 加熱促進(jìn)石蠟性質(zhì)的改善 熔化冷卻熔化,4、浸蠟的方法 傳統(tǒng)浸蠟法 將透明好的組織放入熔化的石蠟中浸漬一定的時(shí)間。 真空負(fù)壓浸蠟法 將透明好的組織放入浸蠟缸中，然后移入真空負(fù)壓箱內(nèi)，或者脫水機(jī)自身配有的真空負(fù)壓裝置進(jìn)行浸蠟。 浸蠟時(shí)間，真空負(fù)壓數(shù)見表。,真空負(fù)壓浸蠟時(shí)間壓力表,注：1、計(jì)時(shí)應(yīng)以石蠟全部溶化時(shí)計(jì)起。 2、當(dāng)抽氣時(shí)，溫度應(yīng)調(diào)高幾度，至抽氣完成后才調(diào)至所需溫度。,（四）組織包埋 將浸完蠟的組織埋葳于石蠟中的過程稱為組織包埋。 包埋時(shí)的注意事項(xiàng)： 1、所使用的鑷子，包埋框，最好放于37的恒溫箱內(nèi)，以免這些物質(zhì)過冷（在冬天時(shí)）而過早冷卻包埋的石蠟，影響包埋的質(zhì)量，這種現(xiàn)象在沒有石蠟包埋機(jī)的單位較為明顯。,2、打開脫水盒，取出組織塊，將一平整的大的一面朝下，并用鑷子壓平，使其保持在一水平面上。 3、每包埋完一塊，應(yīng)附上標(biāo)簽，以免出差錯(cuò)或張冠李戴。如為塑料包埋盒，則可少去這一步，極為方便。 4、對(duì)于管腔的組織如血管、腸、氣管等應(yīng)豎起來包埋對(duì)于皮膚及胃、腸、等組織應(yīng)辯認(rèn)好方向。仔細(xì)包埋。,5、細(xì)小多塊的組織，可包埋在一個(gè)蠟塊，但應(yīng)保持在同一平面上，以免影響切片。 6、包埋完后，蠟面凝固，便可放入水中加速硬化，如帶有冷凍設(shè)備的包埋機(jī)，則可少去這一步。,7、包埋時(shí)組織塊不能使其冷卻凝固，應(yīng)保持組織塊上的蠟處于熔化狀態(tài)，這樣包埋時(shí)才能和包埋蠟溶為一體。如果組織塊自身的蠟先凝固，包埋后的蠟塊切片時(shí)組織與邊蠟分離切不成佳片嚴(yán)重的會(huì)崩掉，影響切片。,（五）修切蠟塊 應(yīng)用包埋框包埋的組織塊，切片前一定要將其切好，組織塊與邊蠟應(yīng)保持有0.5cm的厚度，才有利于切片。 1、有利于切片，使切片能連續(xù)切出。 2、減少損傷刀口延長刀口的壽命，以利多切蠟塊。 3、有利于切片的裱貼。例如一張載片要裱兩塊組織時(shí)，修切好的蠟塊，就能使它們擺得整齊。,（六）切片和裱片 在操作時(shí)的注意事項(xiàng)： 1、持蠟器一定要將蠟塊挾緊挾牢，以免使其跳動(dòng)而影響切片。 2、刀一定要保持無口、鋒利，一次性刀片做到這一點(diǎn)較容易，大刀片要做到上述要求就比較困難。因此就要認(rèn)真地磨好刀才能保證切片的質(zhì)量。,3、裱片的水溫不能過高或偏低，高者可溶化所切出的切片，低者則展不開切片，使切片留有皺紋，最適的水溫應(yīng)是比石蠟的溶點(diǎn)低2-5，如石蠟的溶點(diǎn)為60-62，裱片的水溫則可達(dá)55-57，余者類推。 4、對(duì)于細(xì)小的組織，應(yīng)特別小心修切，防止一刀切下，全部皆休的情況。,5、對(duì)于多塊細(xì)小的組織，原則上是每一細(xì)小的組織都應(yīng)有一個(gè)切面。修切的時(shí)候更應(yīng)特別小心。 6、每切完一塊，裱于載片后應(yīng)隨時(shí)刻上編號(hào)，以防止差錯(cuò)或混亂的現(xiàn)象發(fā)生，減少差錯(cuò)的苗頭。 7、挑切片的毛筆，應(yīng)選用細(xì)小柔軟的毛筆為佳，用時(shí)向上挑，決不能往下，以免刀口傷及毛筆。,石蠟切片?？沙霈F(xiàn)的問題 1、石蠟切片不能形成帶狀的原因是室溫低，蠟塊周邊不整齊。 2、石蠟切片，切片卷起的原因是刀的傾斜角度過大或刀不快。 3、石蠟切片出現(xiàn)的皺折的原因是石蠟溶點(diǎn)低，純度不足。 4、石蠟切片出現(xiàn)厚薄不均勻的主要原因是組織塊挾不牢固或組織堅(jiān)硬如肌瘤等。,5、石蠟切片出現(xiàn)波浪狀的原因是組織塊太硬或骨組織末完全脫鈣。 6、石蠟切片，當(dāng)切片放入水中裱片時(shí)，切片周圍的蠟迅即向四邊散開，其主要原因是組織脫水不徹底，浸蠟浸不進(jìn)去。包埋蠟中含有二甲苯。 7、石蠟切片，當(dāng)切片切出后蠟塊向上時(shí)，把已切出的切片帶走并損壞的原因是切片刀背面留有殘余石蠟。,8、組織切片常見的人為性色素沉著物是福爾馬林色素，常見的器官是肝、脾。 9、組織切片常見的外源性色素是碳末，常見的器官是肺。 10、石蠟切片時(shí)切片刀的最宜角度是 5-30 11、一般所稱呼的標(biāo)準(zhǔn)室溫是20 12、組織浸蠟的溫度最好為 12、石蠟溶點(diǎn)的最高度高2-3即65。,（七）石蠟切片的烘烤 石蠟切片在染色前，為了防止脫落，都必須進(jìn)行烘烤，以促進(jìn)切片附貼的牢固性。 1、常規(guī)切片烘烤 常規(guī)石蠟切片切完后，在60的烤箱中烘烤20-30min便可進(jìn)行染色。,2、免疫組化切片的烘烤 應(yīng)用于免疫組化染色的切片，由于整個(gè)過程都在沖沖洗洗中進(jìn)行，因此要求切片附貼要十分牢固，以免脫片，烘烤切片的時(shí)間可為1h、1.5h、2h、3h等，均在60的烤箱中烘烤。,病理切片常規(guī)染色,一、染色的目的 病理學(xué)的各種切片，都必須應(yīng)用一種以上的染料通過不同的方法將切片的各種不同的組織結(jié)構(gòu)給予顯示出來，以利于鏡下辨別其各種不同的形態(tài)，做出正確的診斷。,二、染色的作用 1、化學(xué)作用： 染液中的陰陽離子與組織中的陰陽離子相互作用所完成的染色。染液中有酸性和堿性染料之分，酸性染料有染色作用的部分是陰離子，而堿性染料有染色作用的部分則是陽離子。組織的各種細(xì)胞中細(xì)胞核為酸性，它可與蘇木素液中的陽離子發(fā)生反應(yīng)。細(xì)胞槳中的陽離子則與伊紅液中的陰離子發(fā)生反應(yīng)，完成染色。,2、物理作用： 染料通過浸透，分散浸入到組織的間隙中，因受分子的引力作用，染液中的色素粒子被吸附而完成染色過程。 3、染色方法 應(yīng)用于常規(guī)病理切片的染色方法稱為普通染色法或HE染色法，而用特別的染色法則稱為特殊染色法。,HE染色法程序,結(jié)果：細(xì)胞核：藍(lán)色，軟骨基質(zhì)鈣鹽等深藍(lán)色；細(xì)胞漿深淺不同的粉紅色，嗜酸性顆粒鮮紅色；膠原纖維呈粉紅色，肌纖維呈鮮紅色，彈力纖維呈亮紅色，紅血球?yàn)榻奂t色，蛋白基質(zhì)為粉紅色。,染色時(shí)的注意事項(xiàng) （1）切片烘烤以切片附貼牢固為原則，否則容易掉片。 （2）切片脫蠟一定要徹底，不然會(huì)導(dǎo)致染色深淺不一。 （3）切片染蘇木素前可令其無水化，這樣可延長蘇木素的壽命。因?yàn)槊看稳旧?，切片水洗，然后進(jìn)入染液雖然每次帶入的水分很少，但隨著次數(shù)的增加，所帶入的水分足可以稀釋染液影響染色的質(zhì)量。,（4）切片在蘇木素的染色時(shí)間應(yīng)充分寧過勿不足。對(duì)于初學(xué)者來說更應(yīng)過染，否則分化會(huì)過度導(dǎo)致染色過淺。 （5）切片分化時(shí)，要根椐不同的組織來確定分化時(shí)間，并不斷積累經(jīng)驗(yàn)。 （6）伊紅染色時(shí)間也要充分，經(jīng)低濃度灑精時(shí)應(yīng)仔細(xì)觀察，必要時(shí)快速通過，以免過于褪色。,（7）切片致無水酒精后，不要在控干無水酒精時(shí)讓切片干涸，可以不經(jīng)控干直接地進(jìn)入碳酸二甲苯（也可以進(jìn)入二甲苯酒精混合1：1）碳酸有較強(qiáng)的吸水性透明也好很適合南方地區(qū)。 （8）切片從二甲苯中取出封固時(shí)，切不能讓其干涸，因南方地區(qū)空氣潮濕干涸的切片與空氣接觸，可吸收其水份。這樣的切片很容易裉色。切片不干涸，表面被著二甲苯，由于它不溶于水起到與水隔絕的作用。,（9）滴中性樹膠封蓋切片，膠不能太濃，太濃膠難以均勻鋪開，且易產(chǎn)生氣泡，又不能太稀過稀的膠由于二甲苯含量較多，當(dāng)切片干燥時(shí)，二甲苯揮發(fā)掉，膠封的切片收縮，即可導(dǎo)致一半切片沒有被膠封固的結(jié)果。最合適的膠應(yīng)是滴下成珠。,（10）封固切片時(shí)，盛膠的瓶子及瓶蓋四周不要留有余膠，否則瓶蓋難以打開。因此每次用完后都必須將其擦干凈。當(dāng)打不開瓶蓋時(shí)應(yīng)放入烤箱中烘烤，即可打開。 （11）標(biāo)簽附貼要認(rèn)真，不要貼得歪歪斜斜，影響切片的外觀.,染液的配制 (一）蘇木素的配制 1、蘇木素的種類： A、明礬蘇木素（Harris,Mayer, Ehrlich） B、鐵蘇木素（Wiegert,Heidnhain） C、鎢蘇木素（PTAH） D、鉛蘇木素（Soecia）,（1）Harris蘇木素的配制（Harris.l900） 蘇木素 0.5g 無水乙醇 5ml 鉀明礬（硫酸鋁鉀） 10g 蒸餾水 100ml 氧化汞 0.25g 冰醋酸 4ml,預(yù)先把蘇木素溶于無水酒精中配制時(shí)，取一三角瓶倒入蒸鎦水，再加入鉀明礬，于電爐上加熱至90左右時(shí)，拔去電源加入酒精蘇木素，再插上電源繼續(xù)加熱，持續(xù)35分鐘，拔去電源，加入氧化汞，此時(shí)可產(chǎn)生大量的氣泡，應(yīng)防止其溢出瓶外。再繼續(xù)通電加熱，煮沸后持續(xù)35分鐘，此時(shí)溶液表面看呈深紫黑色，即可撤離電源，用備好的冰涼水，將燒瓶迅速的插入水中，讓染液迅速冷卻，中止氧化放入暗處。于第二天過濾后再加入冰醋酸，即可使用，染色時(shí)間515分鐘。,（2）Mayer氏蘇木素（Mayer,1903） 蘇木素 0.1g 蒸鎦水 100ml 鉀明礬 5g 檸檬酸 0.1g 水合醛 5g 碘酸鈉 20mg,將蒸包餾水稍為加溫，加入蘇木素不停地?cái)嚢柚敝寥芙?，再加入鉀明礬，令其溶解后再加入碘酸鈉過濾后即可使用，染色時(shí)間1020分鐘，如果先用天表藍(lán)為媒染劑，染色時(shí)可在23分鐘。,配制蘇木素的注意事項(xiàng) 1、蘇木素可以配成5%或10%，讓其氧化產(chǎn)生蘇木紅，然后根椐每次配制溶液的量，再?zèng)Q定加入多少。 2、在配制蘇木素時(shí)，三角燒瓶的選擇也很重要，例如，配制500ml 的溶液，應(yīng)選用15002000ml的三角燒瓶，配制1000ml則可選3000ml的燒瓶，這樣溶液在加入氧化汞時(shí)，才不會(huì)噴出瓶外。,3、冰醋酸一定要在溶液過濾后加入如果過濾前加入，則在過濾時(shí)溶液很難通過濾紙，這主要是冰醋酸草可造成對(duì)濾紙的損害。,(二）伊紅的配制 1、1%伊紅灑精的配制 伊紅（水溶） 5g 70%-75%酒精 500ml 取少許蒸餾水來溶解伊紅或稱曙紅，當(dāng)完全溶解后，再加入酒精，然后再加入少許冰醋酸，此時(shí)溶液即可變?yōu)轷r紅色。 注意：冰醋酸一定要加進(jìn)去如果沒有加入冰醋酸，細(xì)胞漿將難以染得鮮艷。,1、切片機(jī)的使用，應(yīng)如何注意保養(yǎng)？ 切片機(jī)座應(yīng)注意平穩(wěn)，切片時(shí)應(yīng)注意搖轉(zhuǎn)速度的快慢要盡量保持均勻一致?；瑒?dòng)面要經(jīng)常滴上機(jī)油，以利于滑動(dòng)及旋轉(zhuǎn)自如和防銹，切片完后除去殘蠟，取下切片刀，先用濕布擦去余蠟，繼用干布擦干，再用油布擦一遍，最后用罩蓋好切片機(jī)，以防灰塵落于機(jī)上，影響機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)。,2、化學(xué)試劑使用時(shí)的注意事項(xiàng) （1）已打開的藥品或染色時(shí)的玻璃瓶染色液，每次用后即隨手蓋緊，以免揮發(fā)，易揮發(fā)易吸潮的藥品用后蠟封。 （2）易燃的試劑要遠(yuǎn)離火種，謹(jǐn)防火災(zāi)，因病理科有較多的易燃化學(xué)試劑。,（3）強(qiáng)酸，強(qiáng)堿試劑或有腐蝕性的廢染液，不要直接倒入下水道，以免腐蝕下水道，造成下必要的損失。 （4）易變質(zhì)或易氧化失效的試劑，應(yīng)標(biāo)明配制日期，妥為保存，有的只能一次性用完，因此,應(yīng)本著節(jié)約的原則，用多少，配多少，切勿造成浪費(fèi)。,3、石蠟切片刀應(yīng)怎樣保養(yǎng)好？ 切片刀要經(jīng)常磨，保持鋒利無刀口，每次用完后用布擦干凈，再用油布擦，以防刀口生銹影響切片。 4、如何使樹膠處于中性狀態(tài)？ 取少量無水碳酸鈉，加入到封固用的樹膠中攪拌后放置數(shù)日取其上清液，即為中性樹膠。,5、切片染完蘇木素后的分化，應(yīng)該如何控制和注意什么問題？ （1）分化液中鹽酸不能高于1%，否則會(huì)因分化過強(qiáng)而將已著色的顏色大部分脫水，造成染色過淺。 （2）對(duì)各種組織應(yīng)視情況而定，如淋巴結(jié)的切片，應(yīng)分化較長時(shí)間等。 （3）分化完后，應(yīng)在顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)核中的物質(zhì)不清楚，則應(yīng)繼續(xù)分化至清晰為止。 （4）要認(rèn)真操作，細(xì)心觀察，不斷總結(jié)。,6、切片欠佳表現(xiàn)在哪些方面？ 7、切片欠佳的主要表現(xiàn)有：切片見有刀痕皺折、橫裂、折疊、不全、破碎、組織松散。厚薄不勻或呈波浪狀等現(xiàn)象。,冰凍切片,一、種類： 1、低溫恒冷箱切片法 2、二氧化碳冰凍切片法 3、甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法 4、半導(dǎo)體冰凍切片法 5、氯乙烷冰凍切片法,二、冰凍切片的目的 1、在手術(shù)進(jìn)行中。突然發(fā)現(xiàn)病人的病變與原診斷不相符合或者懷疑時(shí)需要病理給予確定。 2、了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞或者轉(zhuǎn)移的程度，以利于確定以后的治療措施。,3、對(duì)于已確定惡性腫瘤的病人則需要了解其手術(shù)范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤細(xì)胞。 4、在剖腹探查所發(fā)現(xiàn)的腫塊。 5、顯示組織中的脂肪類物質(zhì)。 6、某些酶的顯示如ATP酶琥珀酸脫氫酶等。 7、神經(jīng)病理學(xué)中的某些染色法。 8、對(duì)某些物質(zhì)所進(jìn)行的免疫熒光的研究。,三、冰凍切片的操作 （1）本室現(xiàn)有Shandon-AS620E型冷凍切片機(jī)的主要性能。左邊的切片臺(tái)可達(dá)到-60左右，冷凍箱內(nèi)在0-30間可任意調(diào)節(jié)，箱面上有電子控制板，裝有急速冷凍，即放上標(biāo)本啟動(dòng)該鍵機(jī)器馬上進(jìn)行冷凍工作并持續(xù)10分鐘；有冷凍臺(tái)溫度顯示冷凍箱內(nèi)溫度顯示；有即時(shí)除霜內(nèi)溫度顯示；,有即時(shí)除霜鍵，啟動(dòng)該鍵機(jī)器可持續(xù)工作15分鐘，將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉；有照明鍵，啟動(dòng)該鍵可照明工作間；有消毒鍵當(dāng)進(jìn)行一星期的工作后，啟動(dòng)該鍵可對(duì)工作間進(jìn)行消毒；有工作間面的密鎖鍵啟動(dòng)鍵可將工作間鎖住，除此之外該機(jī)的左邊有四個(gè)按鍵兩個(gè)為快速自動(dòng)進(jìn)退、兩個(gè)為微小進(jìn)退、另有一個(gè)手動(dòng)旋鈕，調(diào)節(jié)修塊時(shí)的進(jìn)退。,（2）切片取末經(jīng)固定的組織不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整。最好2424 4mm。 （3）取出組織支承器，放平擺好組織周邊滴上包埋劑，速放入冷凍臺(tái)上冰凍，小組織應(yīng)先取一組織支承器滴上包埋劑讓其凍成一個(gè)小臺(tái)再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 （4）將冷凍好的組織塊夾緊于切片機(jī)上修平切面。,（5）調(diào)好厚度，根椐不同的組織而定，一般在5-10um. （6）調(diào)好防卷板，制作冰凍切片的調(diào)節(jié)，關(guān)建在于防卷板的調(diào)節(jié)，這就要求要細(xì)心，準(zhǔn)確，將其調(diào)校，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?，此時(shí)切片。冰凍切片在第一時(shí)間順利地在刀與防卷板之間通過，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載片，將其附貼上即可。,（7）用于附貼切片的載片，不能存放入冷凍的地方，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的溫差，當(dāng)溫度較高的載片附貼上溫度低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子間的彼此轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力。使切片與載片牢固地附貼在一起。如果用冷藏的載片附貼切片，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。,（8）應(yīng)視不同的組織選擇不同冰凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根椐不同的組織而定，不能一概而論，例如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝臟組織和淋巴結(jié)組織等，冷凍箱的溫度可調(diào)在-10-15左右。切甲狀腺，脾、腎、肌肉等組織,則應(yīng)調(diào)在-15 -20左右。切帶有脂肪的組織如乳腺組織，應(yīng)調(diào)在-25左右，如為大量的脂肪組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30。,四、冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng) 1、防卷板和切片及持刀架上的地方應(yīng)保持干凈經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余及用柔軟的紙張擦。因?yàn)榘駝┏３ＹN在上述的地方。如果不把它們?nèi)コ?，就?huì)影響切片。使切片不能完整切出。 2、應(yīng)用于冰凍切片的組織不能過大過厚，過大難以切出好片過厚冰凍費(fèi)時(shí)，最好的取材應(yīng)在24 24 2cm。,3、冰凍組織前組織放于組織支承器上應(yīng)視組織的走勢(shì)來給予放置，然后四周加上包埋劑，保持周邊的整齊，如出現(xiàn)凹凸不平的地方，可用刀子將其修平，才不致于影響切片。,4、組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液在未能達(dá)到固定前更不能使用。臨床快速冰凍切片不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時(shí)間，二是固定了的組織反而增加了切片的難度。如果使用了未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶，這是因?yàn)楹芤旱墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水份也會(huì)滲入到組織當(dāng)中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水份就存留于組織中形成了冰晶。,5、當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)組織冰凍過度時(shí)，可將冰凍的組織取出來，于室溫中停留片刻，以利于軟化組織，使其不致于過度冰凍。,五、冰凍切片的快速染色 1、用普通染色進(jìn)行染色（HE染色） （1）固定、切片用電吹風(fēng)吹干后于10%的福爾馬林鹽或純丙酮中固定2分鐘后自來水沖洗。 （2）滴少許蘇木素染液于切片上于酒精燈上加熱染色，當(dāng)見有蒸汽時(shí)即可中止染色，快速水洗、分化、用熱水促其藍(lán)化、伊紅對(duì)比染色、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。,2、超聲波快速染色法 （1）固定：切片的固定與上同。 （2）把水洗后的切片插入裝有蘇木素的玻璃瓶中超聲波處理30sec或1min,水洗、分化、放于裝有熱水的玻璃瓶中、超聲波處理30sec,酒精脫水，二甲苯透明封固。,結(jié)果：經(jīng)上述各種方法處理后所制作的切片。細(xì)胞核呈藍(lán)色，軟骨基質(zhì)鈣鹽深藍(lán)色，胞漿呈深度不同的粉紅色，嗜酸性顆粒為鮮紅色，膠原纖維量粉紅色，肌纖維呈鮮紅色，彈力纖維呈亮紅色，切片完整，未見有冰晶出現(xiàn)。,