韓韓 北北 忠忠 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院食品學(xué)院Han Bei-zhong,Prof.PhDCollege of Food Science&Nutritional EngineeringChina Agricultural University抗抗 生生 素素 發(fā)發(fā) 酵酵 生生 產(chǎn)產(chǎn) 技技 術(shù)術(shù)Antibiotics Fermentation Production11.概述概述2.生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)前期研究3.生產(chǎn)菌改良生產(chǎn)菌改良4.生產(chǎn)工藝過程生產(chǎn)工藝過程5.發(fā)酵條件的控制發(fā)酵條件的控制6.提取和精制提取和精制1.Introduction2.Research in Lab3.Strain improvement4.Production processing5.Fermentation control6.Isolation&purification 抗抗 生生 素素 發(fā)發(fā) 酵酵 生生 產(chǎn)產(chǎn) 技技 術(shù)術(shù)Antibiotics Fermentation Production2抗生素抗生素是生物在其生產(chǎn)活動(dòng)過是生物在其生產(chǎn)活動(dòng)過程中所產(chǎn)生，并能程中所產(chǎn)生，并能在低微濃度下有選在低微濃度下有選擇性地?fù)裥缘匾种苹驓缫种苹驓缙渌⑸锘蚰[瘤其他微生物或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞的有機(jī)物有機(jī)物。Antibiotics Any organic substances produced by various organisms that have the power of arresting the growth of other microorganisms or of destroying them.1.概述概述 Introduction3歷史歷史1929年，英國(guó)弗萊年，英國(guó)弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素明發(fā)現(xiàn)青霉素二戰(zhàn)期間，大規(guī)模二戰(zhàn)期間，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)世界上最早用于臨世界上最早用于臨床的抗菌素床的抗菌素 History Penicillin was discovered by Fleming in 1929.World War II,fermented in large-scale The first major antibiotic to be commercialized1.概述概述 Introduction4根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類 (Modes of Action of Antibiotics)抑制細(xì)胞壁合成抑制細(xì)胞壁合成(Cell Wall Synthesis)：青霉素青霉素抑制細(xì)胞膜功能抑制細(xì)胞膜功能(Cell Membrane Damage)：多烯類抗生素多烯類抗生素抑制蛋白質(zhì)合成抑制蛋白質(zhì)合成(Protein Synthesis)：四環(huán)素四環(huán)素抑制核酸合成抑制核酸合成(Nucleic Acid Synthesis)：絲裂霉素絲裂霉素 分類分類 Classification1.概述概述 Introduction5復(fù)制復(fù)制翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄6根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類-內(nèi)酰胺類內(nèi)酰胺類(-lactam)：青霉素類青霉素類 (penicillins)頭孢菌素類頭孢菌素類 (cephalosporins)氨基糖苷類氨基糖苷類(aminoglycosides)：鏈霉素、慶大霉素鏈霉素、慶大霉素大環(huán)內(nèi)酯類大環(huán)內(nèi)酯類(macrolides)：紅霉素、麥迪加霉素紅霉素、麥迪加霉素四四 環(huán)環(huán) 類類(tetracyclines)：四環(huán)素、土霉素四環(huán)素、土霉素多多 肽肽 類類(polymyxin)：多粘菌素多粘菌素 分類分類 Classification1.概述概述Introduction7 HNONSCH3CH3HCOO-H-lactam ring-內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺 環(huán)環(huán)Rnatural penicillin R=CH2-CO-8-內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺 環(huán)環(huán)9兩性霉素兩性霉素Antibiotics are so complex they can only be synthesized in a living system10產(chǎn)生菌的篩選產(chǎn)生菌的篩選抗菌性試驗(yàn)抗菌性試驗(yàn)提取、精制、鑒定提取、精制、鑒定毒性試驗(yàn)毒性試驗(yàn)藥理和臨床試驗(yàn)藥理和臨床試驗(yàn) Screening of a strain Antimicrobial trial Isolation,purification and identification Toxicological trial Medicinal&clinical trial 2生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)前期研究 Research in Lab11 Agar diffusion assayagar plate瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基lawn of test bacteria測(cè)測(cè) 試試 菌菌 苔苔filter papers soakedwith test compounds含含 藥藥 物物 濾濾 紙紙zones of inhibition(no growth)抑菌圈抑菌圈12分分 析析 儀儀 器器Analytical instruments現(xiàn)代分析儀器：現(xiàn)代分析儀器：核磁共振核磁共振毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳氣相色譜氣相色譜高效液相色譜高效液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜Modern analytical instruments:Nuclear magnetic resonance(NMR)Capillary electrophoresis(CE)Gas chromatography(GC)High performance liquid chromatography(HPLC)Mass spectroscopy(MS)AutomationSensitivityAccuracy自動(dòng)靈敏準(zhǔn)確自動(dòng)靈敏準(zhǔn)確13人工誘變法：人工誘變法：紫外線紫外線、X-線、線、r-線線照射照射亞硝基胍亞硝基胍、亞硝酸、亞硝酸、秋水仙素、氮芥等秋水仙素、氮芥等誘變劑處理誘變劑處理Conventional strain selectionPhysical mutagen eg.Ultraviolet RadiationChemical mutagen eg.Nitrosoguanidine(NTG)Improved strain can be selected empirically 3.抗生素抗生素生產(chǎn)菌改良生產(chǎn)菌改良 Strain Improvement14基因工程Genetic Engineering 3.抗生素抗生素生產(chǎn)菌改良生產(chǎn)菌改良 Strain ImprovementRecombinant DNA Technology （DNA重組技術(shù)）克隆克隆15Strain Improvement Scale-upStrain出發(fā)菌株出發(fā)菌株Agar plate平板技術(shù)平板技術(shù)Primaryshake flaskEvaluation搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)Secondary shake flask evaluationdifferent media二級(jí)搖瓶培養(yǎng)二級(jí)搖瓶培養(yǎng)各種培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基Lab fermentor evaluationProductionCondition小型發(fā)酵罐小型發(fā)酵罐模擬生產(chǎn)條件模擬生產(chǎn)條件Mastercell bankWorkingcell bankInoculumDevelopment菌種擴(kuò)大培養(yǎng)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)Pilot plantEvaluation中試生產(chǎn)中試生產(chǎn)ProductionEvaluation生產(chǎn)生產(chǎn)60003003031Possiblerecycle1617Scale-up（比擬放大）比擬放大）models models EL Gadden Jr 200 m3 Same productivity?Limitations?模模 擬擬18搖瓶發(fā)酵搖瓶發(fā)酵 Shake-flask fermentation10-50 ml in 125-500 ml flaskBatch onlyLimited control:temperatureSlow metabolizing carbohydrateAmbient pressureBuffers needed to control pHIn-process sampling difficultVolume decrease by evaporationSolid growth on side wallsAntifoam not neededAgitation limited:shaker speedNo control of dissolved oxygen裝液量：10%(250ml)間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢常壓緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結(jié)垢無需消泡攪拌受限制無法控制溶解氧19攪攪 拌拌 罐罐 發(fā)發(fā) 酵酵 Stirred tank fermentation10-100,000升容量間歇和補(bǔ)料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣2 大氣壓無需緩沖液在線取樣易補(bǔ)料,容量增加 生長(zhǎng)均勻一致需消泡多種攪拌 控制溶解氧:通氣,加壓10-100,000 liter vesselsBatch and feed possibleContinuous control:pH,temperatureAmmonium salts or ammonia neededPressure at two atmospheres possibleNo buffers necessary In-process sampling easyVolume increase by sugar feedVery uniform growthAntifoam often requiredWide variety of impellers and bafflesDissolved oxygen controlled by aeration,pressure20搖搖 瓶瓶 發(fā)發(fā) 酵酵 Shake-flask 裝液量：10%(250ml)間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢常壓緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結(jié)垢無需消泡攪拌受限制無法控制溶解氧10-100,000升容量間歇和補(bǔ)料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣2 大氣壓無需緩沖液在線取樣易補(bǔ)料,容量增加 生長(zhǎng)均勻一致需消泡多種攪拌 控制溶解氧:通氣,加壓攪攪 拌拌 罐罐 發(fā)發(fā) 酵酵 Stirred tank 21菌種 種子制備 發(fā)酵 發(fā)酵液預(yù)處理 提取及精制 成品包裝Strain Preparation of seed Fermentation Treatment of broth Isolation&purification Package of product4.抗生素生產(chǎn)工藝過程抗生素生產(chǎn)工藝過程Antibiotics Production Processing22A scheme of the material flow in an antibiotic production 23A scheme of the material flow in an antibiotic production 連消連消發(fā)酵罐發(fā)酵罐緩沖罐緩沖罐種子罐種子罐24發(fā)酵生產(chǎn)原料發(fā)酵生產(chǎn)原料 Materials for FermentationCarbon source:Beet&cane molassesGlucose,lactose,starchEthanol,methanol GlycerolMaltose syrup,corn syrupCottonseed oil,peanut oil,soy oilLard oil Methyl oleate Tallow碳源碳源:甜菜和甘蔗糖蜜甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇乙醇，甲醇甘油甘油麥芽糖漿，玉米糖漿麥芽糖漿，玉米糖漿綿綿籽籽油，花生油，豆油油，花生油，豆油豬油豬油油酸甲酯油酸甲酯油脂油脂25氮源氮源:綿綿籽籽粉粉玉米粉和玉米浸出液玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面大豆粉和大豆面花生粉花生粉菜籽粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液牛血，酪蛋白水解液乳清乳清魚粉魚粉酵母酵母酵母膏酵母膏肉粉和骨粉肉粉和骨粉 Nitrogen source:Cotton seed meal Corn meal&steep liquorSoybean meal&flour Peanut meal Rapeseed mealBeef blood,Casein hydrolysate Whey Fish mealWhole yeastYeast extractMeat&bone meal 發(fā)酵生產(chǎn)原料發(fā)酵生產(chǎn)原料 Materials for Fermentation26 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基Media for Cell Growth&Final productionComponents Range%組組 成成Glucose/sucrose 3.0-5.0 葡萄糖/蔗糖Starch 淀粉 3.0-5.0Corn steep liquor 3.0-5.0Calcium carbonate 0.5-1.0 碳酸鈣Phosphate 磷酸鹽 0.1-0.5Ammonium sulphate 0.1-1.0 硫酸胺Urea 尿素 0.1-0.5Oil 油 0.1-0.5Fermentation 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基 Components Range%組組 成成Glucose 0.5-1.0Starch 0.5-5.0Corn steep liquor 5.0-8.0 玉米浸提液Soy flour 1.0-5.0Phosphate 0.1-1.0Ammonium sulphate 0.5-1.0 and fed periodicallyOil 1.0 and fed continuouslyCorn syrup fed continuously 玉米糖漿 連續(xù)加料 Tank seed 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基27Stirred tank Fermentation 攪拌發(fā)酵攪拌發(fā)酵tpogoCgFogiColollk A C VorolsClcV toloC285.發(fā)發(fā) 酵酵 控控 制制Fermentation Control Sample AnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressure probeLevel probepH probeTemp.probeDO probeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed29ScaleWeight SignalPump SpeedAmplifierControllerSupervisoryComputer Flow Rate Control 流量控制流量控制30發(fā)發(fā) 酵酵 控控 制制 Fermentation control31菌種菌種(strain)：產(chǎn)黃青霉菌：產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)孢子培養(yǎng)孢子培養(yǎng)(spore cultivation)：25 C,6-7 d種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)(seed cultivation)：25 C，2-3 d 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)(fermentation)：22-26 C,6-7 d加糖控制加糖控制(sugar feeding)：殘?zhí)墙抵粒簹執(zhí)墙抵?.6 青青 霉霉 素素 發(fā)發(fā) 酵酵(1)Penicillin Fermentation32補(bǔ)氮補(bǔ)氮(nitrogen feeding)：氨控制在：氨控制在 0.01-0.05前體前體(precursor)：殘余苯乙酰胺：殘余苯乙酰胺 0.05-0.08溫度控制溫度控制(temperature)：前期：前期 25-26 C 后期后期 23 C通氣與攪拌通氣與攪拌(aeration&stir)：1:0.8 VVM泡沫泡沫(foam)：天然油脂：天然油脂,如豆油如豆油 青青 霉霉 素素 發(fā)發(fā) 酵酵(2)Penicillin Fermentation33Penicillin Fermentation Profile 變化曲線變化曲線349、靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。22.7.1422.7.14Thursday,July 14,202210、雨中黃葉樹，燈下白頭人。21:09:3021:09:3021:097/14/2022 9:09:30 PM11、以我獨(dú)沈久，愧君相見頻。22.7.1421:09:3021:09Jul-2214-Jul-2212、故人江海別，幾度隔山川。21:09:3021:09:3021:09Thursday,July 14,202213、乍見翻疑夢(mèng)，相悲各問年。22.7.1422.7.1421:09:3021:09:30July 14,202214、他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國(guó)見青山。2022年7月14日星期四下午9時(shí)9分30秒21:09:3022.7.1415、比不了得就不比，得不到的就不要。2022年7月下午9時(shí)9分22.7.1421:09July 14,202216、行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。2022年7月14日星期四21時(shí)09分30秒21:09:3014 July 202217、做前，能夠環(huán)視四周；做時(shí)，你只能或者最好沿著以腳為起點(diǎn)的射線向前。下午9時(shí)9分30秒下午9時(shí)9分21:09:3022.7.149、沒有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。22.7.1422.7.14Thursday,July 14,202210、很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。21:09:3021:09:3021:097/14/2022 9:09:30 PM11、成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。22.7.1421:09:3021:09Jul-2214-Jul-2212、世間成事，不求其絕對(duì)圓滿，留一份不足，可得無限完美。21:09:3021:09:3021:09Thursday,July 14,202213、不知香積寺，數(shù)里入云峰。22.7.1422.7.1421:09:3021:09:30July 14,202214、意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。2022年7月14日星期四下午9時(shí)9分30秒21:09:3022.7.1415、楚塞三湘接，荊門九派通。2022年7月下午9時(shí)9分22.7.1421:09July 14,202216、少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。2022年7月14日星期四21時(shí)09分30秒21:09:3014 July 202217、空山新雨后，天氣晚來秋。下午9時(shí)9分30秒下午9時(shí)9分21:09:3022.7.149、楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。22.7.1422.7.14Thursday,July 14,202210、閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。21:09:3021:09:3021:097/14/2022 9:09:30 PM11、越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。22.7.1421:09:3021:09Jul-2214-Jul-2212、越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。21:09:3021:09:3021:09Thursday,July 14,202213、知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。22.7.1422.7.1421:09:3021:09:30July 14,202214、意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。2022年7月14日星期四下午9時(shí)9分30秒21:09:3022.7.1415、最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。2022年7月下午9時(shí)9分22.7.1421:09July 14,202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022年7月14日星期四21時(shí)09分30秒21:09:3014 July 202217、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。下午9時(shí)9分30秒下午9時(shí)9分21:09:3022.7.14MOMODA POWERPOINTLorem ipsum dolor sit 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