蛋白質組學proteomicswxj課件ProteomicsProteomics 蛋白質組學蛋白質組學博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Proteome&Proteomics 定義定義nProteome：n1994年，由澳大利亞年，由澳大利亞Macguarie大學的大學的Wilkins等等首先提出：首先提出：“蛋白質組指由一個細胞或一個組織蛋白質組指由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部蛋白質的基因組所表達的全部蛋白質”n“proteome”是由蛋白質一詞的前幾個字母是由蛋白質一詞的前幾個字母“prote”和基因組一詞的后幾個字母和基因組一詞的后幾個字母“ome”拼接拼接而成而成博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Proteome&Proteomics 定義定義nProteomics：n蛋白質組學是從整體水平細胞內蛋白質的蛋白質組學是從整體水平細胞內蛋白質的組成組成、結構結構、功能功能及其及其動態(tài)變化規(guī)律動態(tài)變化規(guī)律的科學。的科學。n研究內容包括分析蛋白質組所有組分及它們的表研究內容包括分析蛋白質組所有組分及它們的表達水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、達水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、互作機制、生物活性及相應特定功能等?；プ鳈C制、生物活性及相應特定功能等。n由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識謝等過程的整體而全面的認識 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Genome&Proteome博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Genomics Transcriptomics&Proteomics博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Proteomics&Structural Genomics博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Proteomics&Functional Genomics博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件特點之一 整體性博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件特點之二 系統(tǒng)性博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件特點之三 動態(tài)性博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件nStructural Proteomics n結構蛋白質組學結構蛋白質組學nFunctional Proteomics n功能蛋白質組學功能蛋白質組學 分類博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Structural ProteomicsnSeparationnIdentificationnPTM(post-translational modification)IdentificationnComparison&Subtraction Analysis 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Functional Proteomics nLocalizationnProtein Complex DeterminationnProtein-Protein Interaction/Interaction NetworknFunction of Protein(Metabolic and Regulatory Pathway;Signal Transduction Pathway)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n 蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結合生物質譜、Western印跡、蛋白質芯片等技術，對蛋白質進行全面的鑒定研究。n 翻譯后修飾的鑒定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。n 蛋白質功能確定：包括蛋白質定位研究，蛋白質活性，蛋白質相互作用，酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基-受體結合分析等。蛋白質組學的主要任務蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組學研究思路與方法蛋白質組學研究思路與方法策略、技術、工具策略、技術、工具博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件主要專業(yè)術語及其英文對照和縮寫主要專業(yè)術語及其英文對照和縮寫nIPG-IEF：固相固相pH梯度等電聚焦（梯度等電聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing）nSDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳（泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）n2-DE：雙向電泳雙向電泳(Two Dimensional Electrophoresis)nHPLC：高效液相色譜高效液相色譜（High performance Liquid Chromatography）nMALDI-TOF MS：基質輔助激光解吸電離飛行時：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（間質譜（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http:/）n基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，http:/EMBL；http:/）n蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite；http:/）n蛋白質二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結構數(shù)據(jù)庫（PDB，http:/；FSSP，）n蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASE，http:/databases/OGLYCBASE）蛋白質組學研究相關數(shù)據(jù)庫蛋白質組學研究相關數(shù)據(jù)庫博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件研究策略研究策略n兩條互補的實驗流程兩條互補的實驗流程n基于凝膠的工作流程基于凝膠的工作流程（Gel-based workflow）n基于液相色譜的工作流程基于液相色譜的工作流程（LC-based workflow）博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Classical GE&LC to Protein ID Gapelo(2010)J ProteomicsHPLC-MS博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件v雙向電泳（two dimensional gel electrophoresis,2D-GE）v差示電泳（differential gel electrophoresis,DIGE）v毛細管電泳 (capillary electrophoresis,CE)v高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分子篩柱層析分子篩柱層析 反向柱層析反向柱層析v質譜分析(mass spectrometry MS)基質基質輔助激光解吸離子化輔助激光解吸離子化-飛行時間串聯(lián)質譜飛行時間串聯(lián)質譜(matrix-assisted laser disorption ionization-time of flight/tandem MS,MALDI-TOF/MS/MS)電噴霧離子化電噴霧離子化串聯(lián)質譜串聯(lián)質譜（electrospray ionization ESI-MS）v生物信息學博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組學實驗室所需的條件蛋白質組學實驗室所需的條件博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組學研究的基本技術路線蛋白質組學研究的基本技術路線蛋白質樣品的制備蛋白質樣品的制備雙向電泳或雙向電泳或HPLC圖像分析圖像分析凝膠中的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白質質量蛋白質質量N端測序端測序肽序列質譜數(shù)據(jù)肽序列質譜數(shù)據(jù)肽指紋圖肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白翻譯后修飾的鑒定翻譯后修飾的鑒定酶解酶解博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Sample Protein PreparationUsually the complexity of the protein and/or peptide mixture lies beyond the theoretical separation space of any separation method.Proteome Complexity.Genomic transcription in diversity;post-transcription processing;post-translational modification;constitution of combinatorial complex.It requires quite a long time for analysis of protein complex.Sample recovery low through separation:more steps,less overall recovery.The conc.of the proteins with a range of 6-order magnitude:in tissues,protein concentrations span a dynamic range of six orders of magnitudes(for regulatory protein or TFs a few molecules per cell,for housekeeping proteins million copies per cell).So,it is difficult to detect very low concentrated proteins in the presence of highly abundant proteins.The complex protein samples with limited stability due to existence of enzymes and proteases,enzyme inhibitors can only partly stabilize the sample.博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Many parameters influence the composition of proteome between induced and inherent biological variations,such as genetic differences,gender and age of patients and cell growth conditions.This requires sample replicates.(statisticians would demand at least five replicates,in many cases three replicates can deliver highly confident results.In clinical the number of required proteins are much high).Membrane proteins are very difficult to solubilize,and easy to loss during sample preparation and separation by sticking to a surface or aggregation.Post-translational modifications(PTMs)like phosphorylation and glycosylation require sophisticated analysis tools like MSn,where the peptide ions generated several times fragmented.Sample Protein Preparation博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-樣品預分離樣品預分離n樣品的制備（預處理）樣品的制備（預處理）：n組織組織n細胞細胞n細胞器（線粒體、葉綠體、細胞核）細胞器（線粒體、葉綠體、細胞核）博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-蛋白提取蛋白提取n重要性：重要性：n在制備時丟失的蛋白永遠不能在后面實驗中彌補在制備時丟失的蛋白永遠不能在后面實驗中彌補n原則：原則：n使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài) n防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀 n防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）飾（如酶性或化學性降解等）n完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-蛋白提取蛋白提取n步驟：步驟：n破碎破碎n沉淀蛋白沉淀蛋白n去除雜質去除雜質博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-蛋白提取蛋白提取n樣品制備流程樣品制備流程-破碎破碎盡可能減少蛋白水解盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則其它形式蛋白降解原則n機械法（超聲波法、高壓法機械法（超聲波法、高壓法、機械勻漿法、機械勻漿法）n化學法（去污劑法、酶裂解法化學法（去污劑法、酶裂解法）n物理法（液氮研磨法、反復凍融法、滲透物理法（液氮研磨法、反復凍融法、滲透法法、玻璃珠破碎法、玻璃珠破碎法）博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-蛋白提取蛋白提取n樣品制備流程樣品制備流程-沉淀蛋白沉淀蛋白 去雜濃縮后蛋白可溶性是關鍵去雜濃縮后蛋白可溶性是關鍵 n三氯醋酸（三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法丙酮沉淀法 nTCA沉淀法沉淀法 引起降解引起降解/修飾修飾 n丙酮沉淀法丙酮沉淀法 n硫酸銨沉淀法硫酸銨沉淀法 影響影響IEFn醋酸銨沉淀法醋酸銨沉淀法 步驟繁瑣步驟繁瑣 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2D電泳結果影響因素分析電泳結果影響因素分析博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-蛋白提取蛋白提取n樣品制備流程樣品制備流程-去除雜質去除雜質 關鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾關鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾 n核酸的清除核酸的清除（DNase/RNase）n多糖的清除多糖的清除（超離心（超離心、TCA沉淀等）沉淀等）n去污劑的清除去污劑的清除（丙酮沉淀法等）（丙酮沉淀法等）n鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）丙酮沉淀法）博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2D電泳結果影響因素分析電泳結果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：可能原因：TCA殘留致使殘留致使Pr丟失丟失博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術-蛋白提取蛋白提取n樣品制備注意事項：樣品制備注意事項：n蛋白質水解蛋白質水解-蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑(PMSF等等)n特殊樣品的制備特殊樣品的制備(低豐度低豐度、強堿性蛋白質、強堿性蛋白質（核糖體）、極端分子量（核糖體）、極端分子量)n樣品定量樣品定量 n重復性重復性博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件nTwo Dimensional Gel Electrophoresis(2D-GE)nDifferential Gel Electrophoresis(DIGE)Gel Electrophoresis博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Workflow for Two-Dimensional Electrophoresis(2-DE)GE(2004)2-D Electrophoresis 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件two dimensional gel electrophoresis(2D-GE)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Isoelectric Focusing Electrophoresis(IEF)IEF mainly applied for the following purposes:n1st dimensional fractionation of protein mixtures in high-resolution 2-D electrophoresis nPre-fractionation of protein mixtures according to chargenFor the separation of very heterogeneous mixtures of tryptic peptides instead of strong cation exchange chromatography in MDLC-MSIPG immobilized pH gradientIPG Strip for IEFpH10.0 Cathode(-)pH 3.0Anode(+)pH103博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件IEF is performed in a pH gradient gel.Proteins Charged with Anion(-)or Cation(+)depend on(i)their molecular traits due to their acidic and basic groups,and(ii)the environmental pH.Environmental pH:in basic buffer,the acidic groups of proteins with negative charge;in acidic buffer,the basic groups with positive charge.Protein Isoelectric Point(pI):At a pH value,the net charge of a protein is zero.39IEF Theoretical Background 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件40The Principle of Isoelectric Focusing Electrophoresis博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件IEF PrincipleAmpholytes to Create A pH Gradient:A Heterogeneous Mixture of Isomers of aliphatic oligoamino-oligocarboxylic acids under electricity field could align themselves due to individual molecule trait&create a pH gradient along cathode with high-pH to anode with low-pH.Ampholyte Properties:(i)high buffering and solubility in its pI(ii)good and regular electric conductivity at its pI(iii)absence of biological effect(iv)low molecular weightThe Ampholyte-Gel:the ampholyte 2%(w/v),the gel 4%(T)&3%(C)Immobile pH Gradient Strip for Proteins Separation(IPG):(i)proteins applied to a position on the IPG strip could be charged with anion,cation and zero(ii)protein-cation moves forward cathode and stop the site where the pH value is equal to the pI of protein-cation;similarity for protein-anion to move forward anode and stop;protein-zero to be naive to move.41博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件42Immobilized pH Gradient PolyacrylamideThe General Structure of Immobiline(Ampholyte)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件雙向凝膠電泳（雙向凝膠電泳（2-DE）n是是等電聚焦電泳等電聚焦電泳和和SDS-PAGE的組合的組合n即先進行等電聚焦電泳（按照即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離）分離）n然后再進行然后再進行SDS-PAGE（按照分子大?。ò凑辗肿哟笮。﹏凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質圖凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質圖 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術n2D-SDS-PAGE：n樣品制備樣品制備n第一向第一向IPG-IEF電泳電泳nIPG平衡平衡n第二向第二向SDS-PAGE電泳電泳n染色（銀染）及染色（銀染）及 圖譜分析圖譜分析n目標蛋白獲取及其鑒定（目標蛋白獲取及其鑒定（MC分析）分析）博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2-DEn第一向第一向IPG-IEF電泳nIEF是一種根據(jù)樣品的是一種根據(jù)樣品的等電點不同等電點不同而使它而使它們在們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術梯度中相互分離的一種電泳技術n將等電點不同的蛋白質混合物加入有將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯梯度的凝膠介質中，在電場內經(jīng)過一定時間度的凝膠介質中，在電場內經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的的pH位置上，形成分離的蛋白質區(qū)帶位置上，形成分離的蛋白質區(qū)帶n從而得知其等電點信息從而得知其等電點信息博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件IPG-IEF電泳電泳博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2-DEn第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳n聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結構，具有濃縮聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結構，具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應效應、電荷效應、分子篩效應。SDS與蛋與蛋白質形成雪茄狀帶負電荷復合物，從而消白質形成雪茄狀帶負電荷復合物，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度電泳速度僅與分子量有關僅與分子量有關 n從而得知其分子量信息從而得知其分子量信息博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳n凝膠濃度與其對應的分離范圍凝膠濃度與其對應的分離范圍膠濃度膠濃度 分離范圍分離范圍(KD)5%36-200 7.5%24-200 10%14-200 12.5%14-100 15%14-60博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳Ettan Dalt twelve電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE電泳電泳Ettan Dalt six電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2-DE 凝膠蛋白質斑點的檢測凝膠蛋白質斑點的檢測n染色：染色：1）考馬斯亮蘭染色法；）考馬斯亮蘭染色法；2）銀染法；）銀染法；3）負染法；）負染法；4）熒光染色法；）熒光染色法；5）放射性同位素標記法等）放射性同位素標記法等博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n安全（安全（safety）n靈敏（靈敏（sensitivity）n簡單（簡單（simplicity）n特異性（特異性（specificity）n快速（快速（speed）n穩(wěn)定（穩(wěn)定（stability）n兼容性（兼容性（synergy）理想顯色劑的7S博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件有機染料和銀染n考馬斯亮藍考馬斯亮藍染色靈敏度為染色靈敏度為30100ng30100ng，線性范圍是，線性范圍是2020倍；倍；硝酸銀染色硝酸銀染色的線性范圍是的線性范圍是4040倍，靈敏度是考染的倍，靈敏度是考染的100100倍。倍。n膠體考馬斯亮藍膠體考馬斯亮藍染色技術可實現(xiàn)染色技術可實現(xiàn)PAGEPAGE的無背景染色，其的無背景染色，其極限靈敏度為極限靈敏度為810ng810ng，但這種染液會對蛋白質進行修飾，但這種染液會對蛋白質進行修飾而影響質譜分析的結果。而影響質譜分析的結果。n氨基黑氨基黑常用于轉印至聚偏二氟乙烯（常用于轉印至聚偏二氟乙烯（PVDFPVDF）和）和/或硝酸或硝酸纖維素膜上的蛋白質的染色。纖維素膜上的蛋白質的染色。n銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質染色效果差，對其銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質染色效果差，對其后的蛋白質測序和質譜分析造成影響。后的蛋白質測序和質譜分析造成影響。n這兩類染色技術都可減少膠內蛋白質產量這兩類染色技術都可減少膠內蛋白質產量。博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件負 染n能專門能專門提高提高PAGE膠上蛋白質的回收率膠上蛋白質的回收率，但不能用，但不能用于膜上染色。于膜上染色。n結果表現(xiàn)為結果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質點透明膠面著色而蛋白質點透明。n速度快（速度快（515min），蛋白質的生物活性能保持：），蛋白質的生物活性能保持：一旦用絡合劑如一旦用絡合劑如EDTA或或Tris/甘氨酸轉移緩沖液來甘氨酸轉移緩沖液來絡合金屬離子就可進行提取來轉移蛋白質。絡合金屬離子就可進行提取來轉移蛋白質。n它主要適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被它主要適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被動提取以及質譜分析。動提取以及質譜分析。n該技術主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的該技術主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的使用。使用。博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件膠體擴散染料n主要用于主要用于高靈敏度檢出電轉印至硝酸纖維素高靈敏度檢出電轉印至硝酸纖維素和和PVDF膜上的蛋白質膜上的蛋白質，不用于膠內染色。，不用于膠內染色。n最好的膠體金染色的靈敏度與最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內的膠內的銀染類似。銀染類似。n這種技術主要包括這種技術主要包括麗春紅、印度墨水染料、麗春紅、印度墨水染料、膠體金染料膠體金染料等。等。博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件有機熒光團染料n包括共價結合和非共價結合的熒光團染料兩類。后者最為包括共價結合和非共價結合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等熒光染料。等熒光染料。n這三種染料可對這三種染料可對SDS-PAGE膠內蛋白質進行一步染色，約膠內蛋白質進行一步染色，約3060min完成，靈敏度為完成，靈敏度為210ng。染色后的凝膠用標準的。染色后的凝膠用標準的實驗室實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個個數(shù)量級。數(shù)量級。n這三種染料的電泳染色結果與在酵母中通過這三種染料的電泳染色結果與在酵母中通過SAGE所獲得所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。n在在Tris/甘氨酸轉印緩沖液中染色后，蛋白質可被轉印至膜甘氨酸轉印緩沖液中染色后，蛋白質可被轉印至膜上并進行免疫染色或上并進行免疫染色或Edman測序來鑒定蛋白質。測序來鑒定蛋白質。博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件金屬螯合染料n這是一類與現(xiàn)代蛋白質組學研究相兼容的、這是一類與現(xiàn)代蛋白質組學研究相兼容的、相對較新的蛋白質顯色試劑，其設計專門與相對較新的蛋白質顯色試劑，其設計專門與常用微量化學表征過程兼容。它們不包含戊常用微量化學表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化等，很容易和集成化蛋白質組學平臺（包括自動化凝膠染色儀、蛋白質組學平臺（包括自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質酶解工作站和質譜儀等）相結合。酶解工作站和質譜儀等）相結合。n其中其中SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。光染料。博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件 靈敏度 20pg博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2DE重復性重復性The same protocol and sample,however not the same resultsRec:similar;cir:different 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件DIGE&Proteins Labeled with CyDyesProteins labeled with CyDyes:with dyes cyanine(Cy2 blue,Cy3 red,Cy5 green),the dyes cannot influence protein property as well as its molecular weight much.The Mixed Run on 2-DE:the mixed ratio at 1:1,run on the same 2-DE,the same kind of proteins with different dyes from different samples can co-migrate.The Mixed Gel Scanned:with laser scanner to scan the mixed ran gel at different wavelengths according to CyDyeThe Result Read out:the position and the color of the protein spots on DIGE image,the position to represent the protein ID,the color,according to standard color calibrator to infer each dye the proportion to the dye mix,to represent the relative amount of the same kind of protein among different samples.64博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件650C x 30 minGE(2004)2-D ElectrophoresisLysine Labeling(minimal labeling)In practice 400 pmol of dye is added to 50ug of protein.In this way only 3-5%of the proteins will receive a tag(95-97%remain unlabeled)1.Labeling reaction:no IPG buffer,no reductant,pH 8.5,37,30 min with dye,the epsilon-amino side group of lysine is labeled with dye.博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件66Cysteine Labeling(saturation labeling)The high sensitivity,down to 1000 human cells(around 2.5 ug protein)could provide good 2-DE 1.Labeling reaction:no IPG buffer;TCEP reductant pH 8.0,37,1h;dye added pH 8.0,37 30 min;the thio group of cysteine labeled with dyes(Cy3 or Cy5).博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件67Workflow for 2-DE of Proteins Labeled with CyDyes博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件68Workflow for DIGE of Proteins Labeled with CyDyesGE(2004)2-D Electrophoresis博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件69Proteins Labeled with CyDyesMix Labeled Proteins 2-DELaser Scanner with Different WavelengthsIndividual&Overlap Image Analysis(Protein Spot Location&Color)Identification of Protein ID&Abundance1st IEF(pI)2nd SDS-PAGE(Mw)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Example for DIGE Images Scanned with Difference WavelengthProteomics in Practice p6970博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2-DE 凝膠蛋白質斑點的檢測凝膠蛋白質斑點的檢測n圖像掃描和分析圖像掃描和分析Image Scanner II博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件2-DE 凝膠蛋白質斑點的檢測凝膠蛋白質斑點的檢測n全自動斑點切取系統(tǒng)（全自動斑點切取系統(tǒng)（Ettan Spot Picker）博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件v質譜原理：質譜原理：樣本分子離子化后,根據(jù)不同離子間質荷比(m/e)差異,分離樣本,確定分子量2-DE 凝膠蛋白質斑點的檢測凝膠蛋白質斑點的檢測博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Principle for Mass Spectrometry74Schematic of Quadrupole TOF Hybrid AnalyzerWestermeier(2008)Proteomics in Practice博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件電噴霧質譜電噴霧質譜博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n樣品溶于固定的底樣品溶于固定的底物中形成晶體，用物中形成晶體，用激光脈沖使其離子激光脈沖使其離子化化，離子被加速后，離子被加速后通過飛行管時分離，通過飛行管時分離，所有離子均可被檢所有離子均可被檢測，常用來測測，常用來測蛋白蛋白質質、多肽、核酸和多肽、核酸和多糖等生物大分子多糖等生物大分子MALDI-TOF MS博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n通過質譜分析，可以獲得分析樣品的通過質譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子分子量、分子式、分子中同位素構成和分子結構式、分子中同位素構成和分子結構等多方面的信息等多方面的信息SARS病毒病毒N蛋白整體分子量蛋白整體分子量 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n蛋白質經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的蛋白質經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的分子質量，形成一個特異的肽質量指紋圖譜分子質量，形成一個特異的肽質量指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF），通），通過數(shù)據(jù)庫搜索與比對，便可確定待分析蛋白過數(shù)據(jù)庫搜索與比對，便可確定待分析蛋白質分子的性質質分子的性質。Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件n用用PMF方法未能鑒定的蛋白質可通過質方法未能鑒定的蛋白質可通過質譜技術獲得該蛋白質一段或數(shù)段多肽的串譜技術獲得該蛋白質一段或數(shù)段多肽的串連質譜信息（氨基酸序列）并通過數(shù)據(jù)庫連質譜信息（氨基酸序列）并通過數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定該蛋白質。檢索來鑒定該蛋白質。n混合蛋白質酶解后的多肽混合物直接通過混合蛋白質酶解后的多肽混合物直接通過（多維）液相色譜分離，然后進入質譜進（多維）液相色譜分離，然后進入質譜進行分析。行分析。用串聯(lián)質譜（MS/MS）鑒定蛋白質博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件用串聯(lián)質譜（MS/MS）鑒定蛋白質博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析串聯(lián)質譜（串聯(lián)質譜（Tandem-MS）,第一級質譜得到肽的分子離子第一級質譜得到肽的分子離子,選取目標肽的離選取目標肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即即N端碎片離子系列（端碎片離子系列（B系列）和系列）和C端碎片離子系列（端碎片離子系列（Y系列），將這些碎系列），將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“protein ladder sequencing”的方法，通過對的方法，通過對Edman降解法的修改，產降解法的修改，產生一系列截去生一系列截去N端殘基的肽段，用端殘基的肽段，用MALDI-MS測得這些肽段的質量，從而測得這些肽段的質量，從而推測推測N端序列。端序列。博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件84The protonated total peptide mass is 1410.6.The peptide to be ionized into N-terminal ions(b-ions)and C-terminal ions(y-ions).The alignment of these ions of the peptide from small to large according to their m/z,a unique mass spectrum for the peptide.The signal intensity(the height)of each ion represents the abundance of the fragment ion in system.Contrast of b-ions to y-ions could infer the peptide sequence.多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Isotope Labeling Protein Samples via Metabolism Campbell(2002)Discovering p189 86Different Isotopes to label different samples via metabolism.Combine the samples at a ratio of one to one from diff sources and to subject to separation,and digestion.Analysis by MS to produce characteristic mass spectrum (1)at every m/z point,two peaks always occurred in couple,representing the same molecule with diff mass isotopes:the front with light isotope and the following with heavy one.(2)at every m/z point,the ratio of two peaks to represent the same molecule relative abundance from diff sources.博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Isotope Tag ICAT for Labeling of Protein Samples in vitro 87ICAT consists of three parts(i)biotin affinity tag,bind reversibly to avidin(ii)a linker,contain 8 stable isotopes(iii)thiol group,bind to cysteine of protein In ICAT molecule,if X groups present with H(=1),the ICAT is the light isotope tag.If X groups present with D(deuterium=2),the ICAT is the heavy isotope tag.The mass difference between H and D in ICAT could be discriminated by MS.博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件88Workflow of Protein Tagged with ICAT for LC-MS Campbell(2002)Discovering 博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Proteins Labeled with ICAT in vitro,Analyzed by MS Campbell(2002)Discovering p19189In vitro proteins from diff sources to be labeled with different ICAT,light and heavy mass.Combine the samples(the light with the heavy)and digest it.With affinity purification against ICAT to isolate protein fragments labeled with ICAT.The ICAT-label fragments to be analyzed by MS,similar to that of labeled with N14 and N15.At a m/z point,there are two mass peaks,the same molecule,from different sources,labeled with the light and the heavy ICAT.The peak ratio represents the same molecule with relative abundance according to diff sources.博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件90Quantification and Identification Proteins by ICATCampbell(2002)Discovering 蛋白質組學proteomicswxj課件蛋白質功能研究技術蛋白質功能研究技術功能蛋白質組學功能蛋白質組學博學至精博學至精 明德至善明德至善蛋白質組學proteomicswxj課件Techniques for Study of Protein-Protein InteractionsProtein MicroarrayPull down Immunoprecipitation（Co-IP）&Western BlottingY2H System(yeast two-hybrid system)Fluorescence Resonanc