第二節(jié)分配色譜,一、基本原理,1、吸附色譜的局限性（1）吸附色譜不適合于分離強(qiáng)極性的親水性物質(zhì)（成分）；（2）吸附劑的含水量對吸附劑的吸附能力影響較大，常使結(jié)果重現(xiàn)性較差；（3）易出現(xiàn)拖尾峰。,2、分配色譜原理（1）固定相為液體將某種溶劑涂布在吸附劑顆粒表面或紙纖維上，形成一層液膜，稱為固定相。吸附劑顆粒表面或紙纖維叫載體或擔(dān)體。根據(jù)組分在兩相中的溶解度不同而分離。（2）“相似相溶”原則極性物質(zhì)在極性溶劑中溶解度大，K大；非極性物質(zhì)在非極性溶劑中溶解度大，K大。（3）分配定律與分配等溫線（4）分配色譜的特點(diǎn)：a、重現(xiàn)性b、峰對稱c、無強(qiáng)烈滯留現(xiàn)象.幾乎適用于各種類型的化合物，特別適宜于親水性物質(zhì)，如極性較大的生物堿、苷類、有機(jī)酸、糖類及氨基酸的衍生物等。,二、載體,只起負(fù)載固定相的作用。要求：惰性、無吸附能力、純凈、顆粒均勻。種類1）硅膠：重現(xiàn)性差2）硅藻土：應(yīng)用最多3）纖維素：紙色譜,三、固定相和流動(dòng)相的選擇,正相分配色譜：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性；固定相：水、緩沖溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例與載體混勻后填裝于色譜柱。流動(dòng)相：石油醚等洗脫順序:極性大的組分保留作用強(qiáng)；極性小的組分保留作用弱,反相分配色譜：固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。固定液：硅油、液體石蠟等極性較小的有機(jī)溶劑。流動(dòng)相：水、各種水溶液（酸、堿、鹽及緩沖液）、與水混合的有機(jī)溶劑。洗脫順序:極性小的組分保留作用強(qiáng)；極性大的組分保留作用弱,四、分配色譜操作注意事項(xiàng),1、兩相溶劑的處理2、上樣量與樣品前處理。3、柱色譜4、紙色譜,第三節(jié)離子交換色譜法(ionexchangechromatography),一、基本原理1、離子交換劑與離子交換過程（1）離子交換劑為一種固體狀可在水溶液中浸潤和溶脹的多孔顆粒，其表面有許多可電離的基團(tuán)，在水中電離時(shí)，有一種離子可在水中自由移動(dòng)，而另一種則在固定相上不能自由移動(dòng)。可自由移動(dòng)的離子可以被其它同類離子置換，即離子交換。,（2）離子交換過程水溶液中（流動(dòng)相中）的各種離子，可與離子交換樹脂上固定的離子基團(tuán)結(jié)合，使原來與其結(jié)合的離子被置換，進(jìn)入流動(dòng)相而發(fā)生置換。,帶負(fù)電的交換基團(tuán)（固定的離子基團(tuán)，如磺酸基、羧酸基）：用于陽離子分離；帶正電的交換基團(tuán)（固定的離子基團(tuán)，如季胺鹽）：用于陰離子分離。,2、分離機(jī)理（1）不同的離子與交換樹脂的結(jié)合力不同，從而固定相對它的保留能力不同，從而造成差速遷移。（2）離子交換平衡：,K大，Na+易與固定相結(jié)合，移動(dòng)慢；反之，移動(dòng)快。tR=tm(1+K)VR=Vm(1+K)=Vm+KVSK為分配系數(shù),平衡時(shí),K為選擇性系數(shù)（交換平衡常數(shù)）,二、離子交換樹脂,1、離子交換樹脂的構(gòu)成由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不溶于水和有機(jī)溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定。,苯乙烯組成長鏈；二乙烯基苯為交聯(lián)劑,2、離子交換樹脂的類型（1）陽離子交換樹脂可交換的離子為陽離子。氫型、鈉型強(qiáng)酸型、弱酸型、中強(qiáng)酸型（COOH、PO3H、SH）例如：磺酸型R-SO3H+(pH范圍寬)*應(yīng)注意pH范圍，否則交換容量急劇下降。（2）陰離子交換樹脂可交換的離子為陰離子。按不同堿性分：強(qiáng)堿型（季胺基團(tuán)）NR3+(pH<11)NH2,NHR,NR2等(pHB3+>C2+>D+大分子量的有機(jī)離子,有較高的親和力,四、流動(dòng)相,1、組成：一般為鹽類的緩沖水溶液（有一定的pH值）。2、對分離的影響,2、對分離的影響流動(dòng)相主要影響組分離子和交換基團(tuán)形成離子對的過程pH對弱酸、弱堿的影響影響其離解平衡，即控制了組分形成離子的程度：離子組分，則K；離子組分，則K不同離子交換劑的pH適用范圍：強(qiáng)酸型：較寬;強(qiáng)堿型：pH6;弱堿型：pH2000）,一、基本原理1、分離機(jī)理（1）前三種是親和力不同而分離；（2）凝膠色譜中組分與固定相之間無作用力，只是根據(jù)分子量大小來分離；（3）凝膠有一定的孔徑分布范圍的多孔物質(zhì)。組分進(jìn)入柱內(nèi)后，全向固定相的孔中擴(kuò)散，保留程度取決于孔和組分分子的大小。小分子:將全部滲入細(xì)孔中,在流經(jīng)柱時(shí),經(jīng)歷的路程最長.中等大小分子:滲入部分較大的孔隙,而被較小的孔隙排斥,經(jīng)歷的路程居中.大分子:完全被排斥在空隙外,經(jīng)歷的路程最短.,所以洗脫次序僅是分子大小(分子量)的函數(shù)。分子大小受分子量,分子幾何形狀（環(huán)球形、螺旋形或棒形）組分分子間的締合程度、組分與流動(dòng)相分子間的締合程度有關(guān)。,SizeExclusionChromatography,2、分配系數(shù)和保留值(1)分配系數(shù)K組分進(jìn)入柱子，從高濃度的流動(dòng)相中向固定相孔隙內(nèi)擴(kuò)散，擴(kuò)散平衡時(shí),a、小分子平衡時(shí)，一半組分在孔隙內(nèi)，一半組分在孔隙外。CS=CmK=1b、大分子（直徑大于固定相孔徑時(shí)），被全部排斥在固定相孔隙之外CS=0K=0c、中等大小分子，直徑介于以上兩種極限之間，0<K<1所以在凝膠色譜中0K1,（2）保留值保留方程VR=Vm+KVS在凝膠色譜中Vm：外水體積（V0）VS：內(nèi)水體積（Vi）當(dāng)K=1時(shí)，VRVmVSV0ViK=0時(shí)，VRVmV0所以，所有組分均在（Vi+V0）體積內(nèi)流出。,二、凝膠類型（自學(xué)）1、葡聚糖凝膠2、聚丙烯酰胺凝膠3、瓊脂糖凝膠4、多孔玻璃凝膠14用于親水性樣品的分離5、聚苯乙烯凝膠（非水溶液樣品親脂性）,三、實(shí)驗(yàn)條件的選擇,分子量較正曲線將分子量不同的組分混合物注入柱子，經(jīng)分離后，分別測得它們的保留體積，以分子量對保留體積作圖，得一曲線，稱分子量校正曲線。圖中，A、B兩點(diǎn)反映了該固定相能夠分離的組分分子量的上限(排斥極限)、下限(全滲透極限)，只有分子量在A、B對應(yīng)量之間的組分才能被分離。,1、凝膠的選擇（主要通過選擇凝膠來改善分離）,2、凝膠的溶脹干凝膠+10倍吸水量的洗脫劑中，緩慢攪拌；注意：時(shí)間足夠長，不易過稀。3、裝柱：不應(yīng)有氣泡。柱長<100cm4、樣品的制備組別分離（粗分）：上樣量可以是柱體積的2530%。K值相近的物質(zhì)（細(xì)分）：上樣量可以是柱體積的25。5、洗脫：洗脫劑應(yīng)與溶脹凝膠的溶劑相同。洗脫劑：水、不同離子強(qiáng)度的溶液、不同pH的緩沖液、水有機(jī)溶劑混合液。6、應(yīng)用：測定大分子物質(zhì)的分子量（如Pr）,