索拉非尼誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬的機(jī)制及意義秦利燕1，王 濱3，倪振洪3，連繼勤3，宋方洲1,2，袁成福1,2，劉革力1,2 （400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室1，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心2；400038 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室3）摘要 目的 探討索拉非尼誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬的機(jī)制及意義。方法 用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后觀察索拉非尼對自噬小體形成的影響；免疫共沉淀法檢測索拉非尼對Mcl-1與Beclin1之間相互作用的影響；使用siRNA沉默自噬相關(guān)基因Atg5或用氯喹抑制自噬后觀察索拉非尼抗肝癌細(xì)胞的效應(yīng)；Western blot檢測自噬與凋亡相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1、LC3、Mcl-1與PARP表達(dá)的變化。結(jié)果 索拉非尼處理HepG2細(xì)胞后LC3-蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性增強(qiáng)，索拉非尼處理后轉(zhuǎn)染GFP-LC3 的HepG2細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的自噬小體樣點(diǎn)狀熒光，Western blot結(jié)果顯示索拉非尼處理后Hepg2細(xì)胞中Mcl-1表達(dá)下調(diào)，Beclin1無明顯變化，Co-IP證實(shí)在Hepg2細(xì)胞中Mcl-1和Beclin1間存在蛋白相互作用，索拉非尼能減弱Mcl-1和Beclin1的結(jié)合。抑制自噬后能明顯增強(qiáng)索拉非尼的殺細(xì)胞效應(yīng)。結(jié)論 索拉非尼可能通過下調(diào)Mcl-1來誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬，抑制自噬后可顯著增強(qiáng)索拉非尼的殺細(xì)胞效應(yīng)。關(guān)鍵詞 索拉非尼；自噬；Mcl-1；凋亡中圖法分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 AMechanism and significance of sorafenib-induced autophagy in HepG2 cellsQin Liyan1, Wang Bin3, Ni Zhenghong3, Lian Jiqin3, Song Fangzhou1,2, Yuan Chengfu1,2, LiuGeli1,2 (2Research Center of Molecular Medicine and Tumor, 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016; 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China) Abstract Objective To investigate the mechanism and significance of sorafenib-induced autophagy in HepG2 cell line. Methods HepG2 cells were transfected with GFP-LC3 plasmid to observe the effect of sorafenib on autophagosome formation. The interaction of Mcl-1 and beclin1 was tested by co-immunoprecipitation (Co-IP). The anti-tumor effect of sorafenib was detected after autophagy inhibition with chloroquine or knock down of autophagy-related gene Atg5 by siRNA. Changes of autophagic and apoptotic proteins Atg5, Beclin1, LC3, Mcl-1, cleaved-caspase 3 and PARP were detected by Western blotting. Results In HepG2 cells, sorafenib upregulated LC3II protein expression in a dose-dependent manner. HepG2 cells transfected with GFP-LC3 plasmid showed autophogosome-like dot fluorescence when treated with sorafenib. Mcl-1 protein level was downregulated while beclin1 remained unchanged when treated with sorafenib, as shown by Western blotting. The interaction between mcl-1 and beclin1 were observed and could be reduced by sorafenib treatment, as shown by Co-IP. The anti-tumor effect of sorafenib was enhanced when autophagy was inhibited. Conclusion Sorafenib may induce autophagy by down-regulating Mcl-1 expression. The antitumor effect of sorafenib is enhanced when autophagy is inhibited.Key words Sorafenib；autophagy；Mcl-1；apoptosisSupported by the National Nature Science Foundation of China (30800410). Corresponding author: Song Fangzhou，E-mail:fzsongcq基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金(30800410)通信作者 宋方洲，E-mail:fzsongcq優(yōu)先出版 肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，在各種惡性腫瘤死亡率中居第3位，且大多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，失去了手術(shù)治療的時(shí)機(jī)，只能選擇非手術(shù)治療1-2。藥物治療尤其是分子靶向藥物治療在肝癌治療中的作用越來越受到重視。索拉非尼（sorafenib）作為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)治療肝癌的分子靶向治療藥物，是一種多靶點(diǎn)多激酶抑制劑，能顯著改善晚期肝癌病人的生存期3-6。自噬是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)高度保守的代謝過程，在饑餓、缺氧和化療等應(yīng)激條件下，細(xì)胞能形成一個(gè)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，包裹受損、衰老的細(xì)胞器和大分子蛋白等，然后與溶酶體融合，在溶酶體酸性水解酶的作用下生成可供細(xì)胞重新利用的氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)。研究表明自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)，各種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬所發(fā)揮的作用不盡相同7。已有文獻(xiàn)報(bào)道索拉非尼能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬8，可能是造成索拉非尼治療抵抗的一個(gè)重要因素，但索拉非尼誘導(dǎo)自噬的相關(guān)機(jī)制還有待于深入研究。本研究以肝癌HepG2為模型，旨在初步探討索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬的一種可能機(jī)制，從而為克服臨床上索拉非尼的治療抵抗問題提供新的思路和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料人肝癌細(xì)胞株HepG2由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)及分子生物學(xué)教研室保存并贈(zèng)送。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰酶購自美國Hyclone公司；siRNA序列由上海吉瑪生物公司合成；Lipofectamine2000Transfection Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；索拉非尼、氯喹、二甲基亞砜和LC3抗體購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和細(xì)胞裂解液購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；Cleaved-caspase3、PARP、-Actin抗體購自美國Cell Signaling公司；Mcl-1、Beclin1、ATG5抗體購自美國Santa Cruz公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；蛋白Marker購自北京中衫公司。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染方法HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上后用0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以每孔按5×105個(gè)左右接種于6孔板，培養(yǎng)18 h后，細(xì)胞融合度達(dá)80%90%，按Lipofectamine2000 Transfection Reagent的說明書操作，轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，24 h后處理組用10 mol/L索拉非尼處理，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察對照組和處理組自噬小體的形成情況。1.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP）收獲10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，加入600 L細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min。4 , 13 000 r/min離心15 min后測定蛋白濃度，取適量蛋白作為Input組，變性后凍存；剩余蛋白分成2份，分別加入對應(yīng)的一抗和對照IgG，4孵育1 h后加入Protein A-Agarose，4 搖晃孵育過夜。用裂解液清洗beads，2 500 r/min離心2 min，共清洗4次后加入Loading Buffer煮沸變性后用于Western blot分析。1.4 RNA干擾實(shí)驗(yàn)(RNAi)Atg5的siRNA序列為5'-GCAACUCUGGAUGGGAUUG-3'，5'-CAAUCCCAUCCAGAGUUGC-3'；陰性對照的siRNA序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siRNA的轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000 Transfection Reagent的說明書進(jìn)行，密度達(dá)到80%左右開始轉(zhuǎn)染。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)6 h后換液，24 h后處理組用10 mol/L索拉非尼處理，48 h后用Western blot方法檢測基因沉默效果及LC3，Cleaved-caspase3表達(dá)變化。1.5 Western blot檢測將處理后的HepG2細(xì)胞用PBS洗滌2次，用細(xì)胞裂解液冰上裂解20 min后4 ，13 000 r/min離心10 min，收集上清，BCA法測量蛋白濃度。將定量后的蛋白以每孔50 g上樣，在12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后采用半干轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜用含5%脫脂奶粉的PBST常溫封閉1 h，再用1:1 000稀釋的第一抗體室溫孵育2 h，經(jīng)PBST洗3次后用1:10 000稀釋的第二抗體室溫孵育1 h，PBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光底物法于暗室顯影曝光。1.6 細(xì)胞凋亡檢測（Hoechst33258染色）處理細(xì)胞后，吸盡培養(yǎng)液用PBS洗兩遍，加入0.5 mL固定液，固定10 min后棄固定液再用PBS洗兩遍后加入0.5 mL的Hoechst染色液染色5 min后于熒光顯微鏡下觀察，熒光染料Hoechst33258能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33258比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高細(xì)胞核呈致密濃染顏色發(fā)白。細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染2結(jié)果2.1索拉非尼誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬在自噬過程中，LC3蛋白從型向型轉(zhuǎn)變是自噬發(fā)生的標(biāo)志性事件9。從圖1可見，不同濃度的索拉非尼處理可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞中型LC3蛋白水平逐漸增加，說明自噬水平呈劑量依賴性升高。Atg5是自噬發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子，Western blot分析發(fā)現(xiàn)索拉非尼作用后Atg5蛋白水平明顯升高（圖1），說明索拉非尼在HepG2細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬可能與Atg5相關(guān)。GFP-LC3熒光蛋白在自噬發(fā)生過程中會(huì)隨著自噬小體的形成而呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集，是自噬檢測中的常用方法10。從圖2可見，10 mol/L索拉非尼處理24 h后經(jīng)GFP-LC3轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的自噬小體樣點(diǎn)狀熒光，進(jìn)一步說明索拉非尼可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬。2.2 抑制自噬可明顯增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Atg5是自噬發(fā)生過程中的關(guān)鍵基因，在索拉非尼處理的HepG2細(xì)胞中表達(dá)量明顯升高（圖1）。轉(zhuǎn)染Atg5 siRNA的HepG2細(xì)胞中，Atg5與LC3-水平明顯下調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子PARP活性顯著增強(qiáng)（圖3），說明下調(diào)Atg5抑制自噬后增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 1 2 3 4 5 Atg5（16×103）LC3 （18×103）-actin（43×103）LC3 （16×103） 1：對照組；2：2.5 mol/L索拉非尼；3：5 mol/L索拉非尼；4：10 mol/L索拉非尼；5：20 mol/L索拉非尼 圖1 Westen blot檢測索拉非尼對HepG2細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg5、LC3表達(dá)的影響 A B A：對照組；B: 10 mol/L索拉非尼 圖2 熒光顯微鏡觀察索拉非尼處理后HepG2細(xì)胞中GFP-LC3熒光蛋白變化情況1 2 3 Atg5（16×103）LC3 （18×103）LC3 （16×103） PARP (116×103） Cleaved PARP (89×103） -actin（43×103）1: 對照組；2：10 mol/L索拉非尼；3：轉(zhuǎn)染Atg5-SiRNA+10 mol/L索拉非尼圖3 下調(diào)ATG5增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的Caspase3活性氯喹由于能夠抑制自噬小體和溶酶體的融合而阻斷自噬進(jìn)程，從而被作為自噬抑制劑使用。從圖4可見，10 mol/L CQ和10 mol/L索拉非尼聯(lián)合用藥以后，LC3-蛋白水平增強(qiáng)，不能通過溶酶體途徑進(jìn)一步降解。而細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白PARP被剪切后活性增強(qiáng)，說明在Hepg2細(xì)胞中自噬抑制劑氯喹增強(qiáng)了索拉非尼的殺細(xì)胞效應(yīng)。Hoechst染色是檢測細(xì)胞凋亡的方法之一。10 mol/L CQ和10 mol/L索拉非尼聯(lián)合用藥以后細(xì)胞核更加致密濃染且顏色發(fā)白，凋亡增強(qiáng)（圖5）。2.4 索拉非尼可下調(diào)細(xì)胞中Mcl-1蛋白水平而使Beclin1解離Mcl-1是Bcl-2家族的抗凋亡分子，近年研究發(fā)現(xiàn)其參與自噬的調(diào)控11。如圖3顯示，索拉非尼處理后HepG2細(xì)胞中Mcl-1蛋白水平呈劑量依耐性的降低。Beclin1作為首個(gè)發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)哺乳動(dòng)物自噬的基因，在自噬啟動(dòng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Western blot分析發(fā)現(xiàn)索拉非尼作用后Beclin1蛋白水平無明顯變化（圖6）。Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞中Mcl-1和Beclin1存在于同一復(fù)合物中（圖7），兩者之間可能存在相互作用，10 mol/L的索拉非尼處理后Beclin1與Mcl-1的相互作用明顯減弱，因此可能通過降低Mcl-1使Beclin1從該復(fù)合物中解離而啟動(dòng)自噬過程。LC3 （18×103）LC3 （16×103）1 2 3 4 PARP (116×103）Cleaved PARP (89×103） -actin（43×103）1: 對照組；2: 10 mol/L CQ；3: 10 mol/L索拉非尼；4: 10 mol/L CQ+10 mol/L索拉非尼圖4 氯喹抑制自噬后明顯增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的PARP剪切A: 對照組；B: 10 mol/L索拉非尼；C: 10 mol/L CQ+10 mol/L索拉非尼A圖5 熒光顯微鏡觀察索拉非尼和氯喹聯(lián)用后HepG2細(xì)胞中細(xì)胞核顏色變化 1 2 3 4 5 Mcl-1 (42×103）Beclin1（60×103）-actin（43×103）1：對照組 2：2.5 mol/L索拉非尼 3：5 mol/L索拉非尼 4：10 mol/L索拉非尼 5：20 mol/L索拉非尼圖6 索拉非尼下調(diào)HepG2細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)IPMcl-1 Mcl-1 IgG Input + 索拉非尼IBBeclin1 Mcl-1 圖7 索拉非尼減弱Mcl-1與Beclin1的結(jié)合3 討論自噬作為一種普遍存在的應(yīng)激代謝過程，其與腫瘤的關(guān)系成為了近年來的研究熱點(diǎn)。目前，已有研究報(bào)道放療、大部分的化療藥物及許多分子靶向藥物在治療腫瘤的過程中均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。適當(dāng)?shù)淖允蓪Υ龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激壓力下的存活具有積極的意義，但多度的自噬則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡12。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞生長過程中通過代謝應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以滿足能量需求，但是如果這種不利的代謝應(yīng)激持續(xù)以致超過細(xì)胞存活的平衡點(diǎn)時(shí)，將發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡13-14。同時(shí)國內(nèi)外越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，自噬地放療、化療和細(xì)胞毒性藥物治療中大多起保護(hù)腫瘤細(xì)胞作用，從而成為藥物耐受的主要原因之一。例如已研究發(fā)現(xiàn)，在抗Her-2的單克隆抗體曲妥珠單抗治療HER2陽性細(xì)胞中增強(qiáng)的自噬明顯增加了細(xì)胞的藥物耐受性，在CML細(xì)胞中通過RNAi干擾技術(shù)或藥物抑制自噬加強(qiáng)了甲磺酸伊馬替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，自噬的抑制也加強(qiáng)了順鉑、5-FU在食管癌和結(jié)腸癌中的治療效應(yīng)等15-16。索拉非尼是治療肝癌的第一個(gè)分子靶向藥物17。本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼能誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬，并且這種自噬作用是有利于HepG2細(xì)胞存活的，可能是肝癌細(xì)胞對索拉非尼產(chǎn)生治療抵抗的一種重要機(jī)制，抑制自噬的發(fā)生能顯著增強(qiáng)索拉非尼的殺細(xì)胞效應(yīng)。Mcl-1是Bcl-2抗凋亡蛋白家族的重要成員，能通過同源結(jié)構(gòu)域3（BH3）與自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1相互作用，從而抑制自噬的發(fā)生18-19。而已被證實(shí)含有BH3結(jié)構(gòu)域，本研究通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Mcl-1與Beclin1存在于同一復(fù)合物中，因此索拉非尼通過下調(diào)Mcl-1而使Beclin1從該復(fù)合物中解離可能代表了索拉非尼誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的新機(jī)制。本研究結(jié)果也證實(shí)，索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬機(jī)制還依賴于另一個(gè)自噬關(guān)鍵基因ATG5，下調(diào)ATG5可抑制索拉非尼的自噬誘導(dǎo)作用。為進(jìn)一步研究索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對HepG2細(xì)胞存活的影響，本研究分別使用自噬抑制劑CQ或ATG5 siRNA抑制自噬后觀察索拉非尼的作用效果，結(jié)果提示抑制自噬可顯著增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)索拉非尼的殺細(xì)胞效應(yīng)。綜上所述，索拉非尼可能通過下調(diào)Mcl-1來誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬，自噬對肝癌細(xì)胞起保護(hù)作用，可能最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對索拉非尼耐藥，而抑制自噬則可顯著增強(qiáng)索拉非尼的殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。本研究對增強(qiáng)索拉非尼的臨床治療效果具有一定的實(shí)驗(yàn)參考價(jià)值。參考文獻(xiàn)：1 秦叔逵，龔新雷, 索拉非尼治療原發(fā)性肝癌的研究進(jìn)展J. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2008, 13(12):1057-1068.2 Llovet J M, Bruix J. 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