第十章 基因工程的操作過(guò)程,1,第一節(jié)、表達(dá)載體的構(gòu)建及導(dǎo)入,目的：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。,使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,2,一、表達(dá)載體的構(gòu)建 科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲能力。 科學(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力。,3,（1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；,（2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；,（3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；,（4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子（增強(qiáng)基因啟動(dòng)子工作效率的順式作用序列，能夠在相對(duì)于啟動(dòng)子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；,（5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,4,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,切口 黏性末端,切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA（重組質(zhì)粒）,同一種,2、過(guò)程:,一個(gè),兩個(gè),兩個(gè),5,3、基因表達(dá)載體的組成：,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因,e、復(fù)制原點(diǎn),表達(dá)載體,6,終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止轉(zhuǎn)錄。 標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而篩選出有目的基因的受體細(xì)胞。,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。,7,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了 、 、 三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到 切割載體，又用到 將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是 。 啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意：,目的基因,啟動(dòng)子,終止子,限制酶,DNA連接酶,磷酸二酯鍵,8,二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,氯化鈣法（感受態(tài)細(xì)胞）,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),9,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法,10,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌：,植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中 ，使植物形成腫瘤。,此類物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中 ，農(nóng)桿菌易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。,11,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,原理：,12,轉(zhuǎn)化過(guò)程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,13,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,（2）基因槍法,適用于單子葉植物,14,（3）花粉通道法,適用于被子植物,15,胚珠,花藥,花絲,柱頭,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,16,子房壁,珠被,珠心 （胚囊）,胚珠,卵細(xì)胞,極核,17,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,滴加目的基因溶液,（3）花粉通道法,18,2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）,思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？,19,（2）操作程序:,提純含目的基因表達(dá)載體,受精卵,顯微注射,移植到子宮,新性狀動(dòng)物,早期胚胎培養(yǎng),2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,20,常用法：CaCl2法（ Ca2+增加細(xì)菌細(xì)胞的通透性）,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,細(xì)菌能夠吸收DNA的狀態(tài),21,受精卵 體細(xì)胞,受精卵,細(xì)胞/個(gè)體,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注 射技術(shù),用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞,22,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài),23,Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：,100 ml 菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體,用10 ml 冰冷的20 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心,用1 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液懸浮菌體,冰浴放置12 - 24小時(shí)，備用,收集菌體,24,Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：,取100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50 ng 載體的重組,冰浴放置半小時(shí),在42保溫 2 分鐘（熱脈沖）,快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘,DNA連接液，混勻,加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增）,涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選,25,細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子,酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,26,電穿孔轉(zhuǎn)化,將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn),27,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)）,28,第二節(jié) 重組子的篩選與鑒定,29,（一）質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的篩選,1、抗生素平板結(jié)合插入失活篩選法根據(jù)標(biāo)記基因是否失活，確定是否有外源基因插入。,一、大腸桿菌重組體的篩選,30,插入失活篩選法的應(yīng)用,兩種情況： 1、雙抗生素抗性基因標(biāo)記載體 2、含一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)lacZ基因的載體,31,1）雙抗生素抗性標(biāo)記的篩選方法,載體攜帶兩個(gè)抗生素抗性基因，外源基因插入其中一個(gè)基因內(nèi)導(dǎo)致其失活，用兩種抗生素平板篩選重組子。 第一步：正選擇。在不進(jìn)行插入失活抗性基因的相應(yīng)抗生素平板上轉(zhuǎn)化子可以生長(zhǎng)，非轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng)，可將轉(zhuǎn)化子直接從平板上挑出來(lái)； 第二步：負(fù)選擇。在插入失活抗性基因的相應(yīng)抗生素平板上轉(zhuǎn)化子中的非重組子（未插入外源基因）可以生長(zhǎng)，重組子（插入外源基因）不能生長(zhǎng)，應(yīng)與第一種抗生素板進(jìn)行對(duì)照并在其上挑出含重組子的菌落。,32,如pBR322質(zhì)粒含有TC r、Amp r兩個(gè)抗藥性基因，外源基因插入失活TC r后，會(huì)有三種不同表現(xiàn)的細(xì)胞: 未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞 TC sAmp s 含載體的轉(zhuǎn)化菌落 Ampr Tcr 含重組體的陽(yáng)性菌落Ampr Tcs,33,34,篩選具體做法,1、用轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布含氨芐的LB平板，長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子Ampr ； 2、用無(wú)菌牙簽將Ampr的轉(zhuǎn)化子逐一挑在Tc平板上（或用無(wú)菌絲絨布、無(wú)菌濾紙影?。容^兩塊板上的菌落生長(zhǎng)情況，從Amp板上挑選出Tc板上不長(zhǎng)的菌落即為重組子。,注意：氨芐平板菌落密度不宜過(guò)大,35,2）藍(lán)白斑篩選法,載體同時(shí)含氨芐青霉素抗性基因和lacZ 基因，外源基因插在lacZ基因內(nèi)，受體細(xì)胞為lacZ 基因互補(bǔ)菌。在同時(shí)含氨芐青霉素和藍(lán)白篩選顯色劑（ X-gal）的平板上篩選： 未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)； 空載體轉(zhuǎn)化菌長(zhǎng)成藍(lán)色菌落； 重組子長(zhǎng)成白色菌落。 例：pUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列、M13噬菌體,lacZ基因編碼-半乳糖苷酶； lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的N端序列片段 ，互補(bǔ)菌染色體上攜帶的缺陷基因編碼C端片斷，兩者互補(bǔ)（-互補(bǔ)）形成有功能的全酶。,36,37,藍(lán)白篩選菌落生長(zhǎng)照片,38,X-gal,5-Bromo-4-Chloro -3-Indoly- -D-Galactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 -半乳糖苷酶顯色劑：生色底物,39,IPTG及其作用,IPTG：即Isopropyl- -D-thioagalactoside，異丙基- -D-硫代半乳糖苷 作用：乳糖操縱子誘導(dǎo)物，和載體上攜帶的大腸桿菌乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因（Lac I ）編碼產(chǎn)物阻遏蛋白結(jié)合，阻止其與操縱基因結(jié)合，使操縱子控制的基因（lacZ等）得以表達(dá)。,含Lac I 的載體：如pUC8，需要誘導(dǎo)物 不含Lac I 的載體：如pUC18/19，不需誘導(dǎo)物,研究中通常為何用IPTG而非乳糖作誘導(dǎo)物？ 乳糖會(huì)被宿主細(xì)胞利用而IPTG不被利用。,40,大腸桿菌乳糖操縱子基因組成,IPTG,41,2、插入表達(dá)篩選,載體的選擇標(biāo)記基因前連接一段負(fù)調(diào)控序列，插入失活負(fù)調(diào)控序列后，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)。 如pTR262質(zhì)粒，在Tc（Tet）基因前有來(lái)自噬菌體的cI基因，可編碼cI阻遏蛋白，抑制Tet表達(dá)。 cI基因（ Hind或Bgl位點(diǎn)）插入失活，Tc基因表達(dá)，受體細(xì)胞在Tc板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)化細(xì)胞及及空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞Tc表達(dá)被抑制，在Tc平板上不生長(zhǎng)。,42,（二）噬菌體DNA重組子的篩選,1、取代型載體：根據(jù)基因組的大小篩選，直接挑取噬菌斑即重組子 機(jī)理： 空載體太小而不被包裝，不進(jìn)入細(xì)胞；重組-DNA可包裝成噬菌體顆粒并感染大腸桿菌產(chǎn)生噬菌斑； 未感染菌生長(zhǎng)成菌落。,43,44,2、插入型載體,空載體及重組載體都可包裝，需要插入失活載體上的標(biāo)記基因篩選。,lacZ 基因插入失活篩選：藍(lán)白篩選 cI基因插入失活篩選：cI篩選,45,選擇標(biāo)記基因,46,1）利用lacZ基因的插入失活篩選重組噬菌斑,如含有l(wèi)acZ基因的M13噬菌體及多種噬菌體載體（ gt11） 重組噬菌斑無(wú)色透明，非重組噬菌斑呈藍(lán)色，未轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)出菌落,47,原理：cI基因編碼的阻遏蛋白可使感染了噬菌體的大腸桿菌進(jìn)入溶原化狀態(tài)； cI基因的插入失活使感染了噬菌體的大腸桿菌由溶原狀態(tài)進(jìn)入溶菌狀態(tài)。 重組噬菌斑：無(wú)色透明 非重組噬菌斑：渾濁 未轉(zhuǎn)化菌：正常菌落,48,Polylinker插入不影響lacZ基因表達(dá),單酶切時(shí)有這種情況,49,噬菌斑,50,2） cI基因插入失活篩選,例：gt10 BNNl02（C600hflA ）系統(tǒng) C600hflA是一種hflA突變菌；cI基因正常表達(dá)的噬菌體在其中溶原生長(zhǎng)，不形成噬菌斑； 但cI基因插入失活的重組噬菌體卻能形成噬菌斑（Young and Davis 1983a）。,hfL：high frequence lysogenization,51,52,二、轉(zhuǎn)化/重組酵母菌的篩選,（一）營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因 （二）顯性標(biāo)記基因,53,（一）利用營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因的篩選方法,原理：受體細(xì)胞為某種營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，即不能合成某種營(yíng)養(yǎng)成分，在缺乏該營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)； 攜帶相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分合成基因的載體轉(zhuǎn)化受體菌后，使細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基（不含某種相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基）中能夠生長(zhǎng)，而未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能生長(zhǎng)。,54,酵母常用營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因,第一類：氨基酸合成基因： 組氨酸合成酶基因HIS4 色氨酸合成酶基因TRP1 亮氨酸合成酶基因LEU2 精氨酸合成酶基因 ARG4 第二類：核苷酸合成基因： 尿嘧啶合成酶基因（URA3）,55,1、含HIS 的載體,分泌型表達(dá)載體主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6； 胞內(nèi)表達(dá)的載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa等,56,57,組氨醇脫氫酶基因（his4）缺失的畢赤酵母,主要有三類：GS115 、 SMDI168 、KM71 均不能合成組氨酸 載體需攜帶his4，轉(zhuǎn)染后的陽(yáng)性重組子可以用不含組氨酸的MM平板進(jìn)行篩選,58,59,2、含URA3 的載體,載體： 酵母菌的Yep系列載體：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶）標(biāo)記基因 受體細(xì)胞：EGY48菌株,Amp、Tc抗性基因用于在大腸桿菌中篩選重組子 URA3標(biāo)記基因用于酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選,60,61,（二）酵母常用顯性標(biāo)記基因,1、氨基糖苷類藥物磷酸轉(zhuǎn)移酶基因： Neo（neomycin）。 2、博來(lái)霉素抗性基因： Zeo（Zeocin）。如pFLD1載體,62,1、Neo選擇系統(tǒng),Neo基因編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，可以滅活氨基糖甙類抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生物G418、卡那霉素等抗生素的抗藥基因。,63,2、Zeo選擇系統(tǒng),Zeo是編碼博來(lái)霉素抗性產(chǎn)物的基因。 博來(lái)霉素（ bleomycin）是一種廣譜抗腫瘤藥。,64,65,（三）酵母其他顯性標(biāo)記基因,1、藍(lán)白篩選基因：LacZ基因 2、銅離子抗性蛋白基因：CUP1基因。編碼一種銅離子螯合蛋白，適合銅離子敏感菌（如釀酒酵母）的篩選。 3、赭石突變抑制基因：sup4,66,利用赭石突變抑制基因 sup4篩選重組酵母菌,酵母菌AB1380（與 YAC 載體配套）的胸腺嘧啶合成酶基因帶有一個(gè)赭石突變 ade 2-1，使其在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，但在缺少某種營(yíng)養(yǎng)素的選擇培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。 當(dāng)帶有赭石突變抑制基因 sup4 的空載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制 ade 2-1基因的突變效應(yīng)，該酵母菌在選擇培養(yǎng)基上形成正常的白色菌落； sup4被外源基因插入失活后重組子呈紅色。,YAC 載體帶有trp 1、 leu 2和 his 3、 ura3 以及 sup4,密碼子改變成UAA的無(wú)義突變又叫赭石突變,67,68,三、重組子的鑒定,核酸分子雜交法 裂解細(xì)菌電泳鑒定分子大小 限制性內(nèi)切酶法 PCR法 基因產(chǎn)物檢測(cè)法 序列分析,69,（一） 核酸分子雜交篩選法,1、Southern印跡雜交： 用標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)目的基因存在與否 步驟： 1、用內(nèi)切酶消化重組子 2、凝膠電泳分離 3、印跡到硝酸纖維素膜上 4、用標(biāo)記的DNA探針雜交，若有帶顯示，說(shuō)明其來(lái)源細(xì)胞為陽(yáng)性重組體。,70,Southern印跡雜交,71,（1）原位雜交篩選 對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。,72,73,（2）R-環(huán)檢測(cè)法 DNA-RNA雜交。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。,74,用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。 主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。,2. Northern blotting （ Northern 雜交）,75,（二）電泳篩選重組子,是從初篩的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)一步篩出重組子的方法。 依據(jù)：重組載體與空載體DNA大小不同，在同一電場(chǎng)的遷移率也不同,適用于插入片段較大的重組子篩選 （重組子與載體電泳遷移率差別較明顯）,76,電泳鑒定分子大小法篩選重組子的步驟,77,（三）限制性內(nèi)切酶法,原理：外源片段通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)插入到載體上，因此，可以用這些限制性酶切割提取的質(zhì)粒DNA，電泳分析插入片段。,用途： 1、區(qū)分期望重組子和非期望重組子 2、判斷插入的DNA分子質(zhì)量 3、判斷平末端連接的插入方向,78,79,80,（四）PCR法,原理：根據(jù)插入DNA片段設(shè)計(jì)特異性引物，以小量抽提的轉(zhuǎn)化子DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，能擴(kuò)增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子。 應(yīng)用： 1、鑒定重組子 2、鑒定插入片斷方向,81,PCR引物設(shè)計(jì)示意圖,引物僅與載體上外源基因兩側(cè)序列或外源基因序列互補(bǔ)時(shí)，只能判斷插入片段有無(wú)及大小而不能判斷插入片段方向； 引物與載體上外源基因兩側(cè)序列及部分外源基因序列同時(shí)互補(bǔ)時(shí)，既可檢測(cè)插入片段有無(wú)及大小，又可檢測(cè)插入方向。,82,（五）蛋白表達(dá)檢測(cè)法,SDS-PAGE Western Blot ELISA,83,1、SDS-PAGE,原理：根據(jù)對(duì)表達(dá)蛋白的大小的了解，電泳后考馬氏亮蘭染色觀察有無(wú)期望帶出現(xiàn) 應(yīng)用：初步檢測(cè)表達(dá)量比較高的蛋白（1mg/L） 方法：制備重組細(xì)胞和非重組細(xì)胞的蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝膠電泳后用考馬氏亮藍(lán)染色；對(duì)比電泳結(jié)果，判斷有無(wú)外源蛋白表達(dá)。,（聚丙烯酰胺凝膠電泳）,84,SDS-PAGE,85,86,2、 Western Blot （ 免疫印跡法）,又稱蛋白質(zhì)免疫印跡（immunoblotting） 原理：先通過(guò)SDS-PAGE使蛋白分開，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜或聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用標(biāo)記的抗體與之反應(yīng)，若有特異條代出現(xiàn)則可表明有特異蛋白表達(dá)。 顯色多用堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶。 應(yīng)用： 初步鑒定蛋白表達(dá)產(chǎn)物的正確性。,87,免疫印跡法操作步驟,一抗：多抗，能夠識(shí)別變性目的蛋白的線性表位 二抗：抗一抗來(lái)源動(dòng)物IgG的抗體,酶標(biāo)底物顯色至膜上； 化學(xué)發(fā)光底物顯色到膠片上； 放射同位素使感光底片顯色,蛋白由膠轉(zhuǎn)移至NC膜或PCDF膜上,88,Western Blot 結(jié)果,89,3、ELISA 檢測(cè)表達(dá)蛋白 （酶聯(lián)免疫吸附）,反應(yīng)模式：Ab-Ag-Ab-酶標(biāo)抗體 抗體包被反應(yīng)孔； 表達(dá)蛋白與抗體反應(yīng)； 酶標(biāo)抗體反應(yīng)； 酶底物顯色。 顯色常用堿性磷酸酶、辣根過(guò) 氧化物酶。,90,91,ELISA 基本原理,一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linked）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。,92,ELISA法特點(diǎn)及應(yīng)用,特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高。 應(yīng)用：適用于從大量轉(zhuǎn)化細(xì)胞集合體中篩選很少幾個(gè)含目的基因的細(xì)胞克隆。 1、定性測(cè)定有無(wú)表達(dá)蛋白。 2、測(cè)定表達(dá)蛋白含量。 局限性：不能檢測(cè)表達(dá)蛋白大小,93,（六） 插入片斷序列分析,1、提取重組子總DNA 2、PCR擴(kuò)增插入片段 3、擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析 4、與目的基因序列比對(duì),94,Clustal X 多序列比對(duì),95,