大豆食品中異黃酮含量的測(cè)定 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 編制 說(shuō)明 （ 征求意見(jiàn)稿 ） 一、任務(wù)來(lái)源 2016年 3月 22 日，由 中國(guó)食品工業(yè)協(xié)會(huì)豆制品專業(yè)委員會(huì)申請(qǐng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)，根據(jù)工業(yè)和信息化部下達(dá)的 2016 年第一季度行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃 ，批準(zhǔn)大豆食品中異黃酮含量的測(cè)定 推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定 本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)食品工業(yè)協(xié)會(huì)豆制品專業(yè)委員會(huì)組織 制定 工作。 二、標(biāo)準(zhǔn)的屬性 本標(biāo)準(zhǔn)是推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。 三、標(biāo)準(zhǔn)的修訂原則 （一）按照食品安全法的相關(guān)規(guī)定，對(duì)現(xiàn)行有關(guān)大豆異黃酮含量的測(cè)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行梳理； （二）結(jié)合國(guó)內(nèi)豆制品企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際情 況，參考國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)； （三）統(tǒng)籌考慮與食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 豆制品有效銜接，確保標(biāo)準(zhǔn)的適用性、廣泛性、可操作性。 本標(biāo)準(zhǔn)的編寫符合 準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第 1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫。 四 、標(biāo)準(zhǔn) 主要內(nèi)容 制定 情況 1、大豆異黃酮是一類從大豆中分離出來(lái)的具有生理活性的物質(zhì)，近年來(lái)被確定為抗腫瘤作用的功能因子，能夠預(yù)防和治療乳腺癌 、結(jié)腸癌和皮膚癌，改善骨質(zhì)疏松，能夠緩解和減輕女性更年期不適癥狀，同時(shí)可提高機(jī)體免疫功能，抗氧化、抗溶血、降低心血管疾病和冠心病的發(fā)生。因此制定科學(xué)有效的大豆制品中異黃酮含量的測(cè) 定方法非常重要。 目前，大豆異黃酮的檢測(cè)主要有高效液相色譜法（ 高效液相色譜 液質(zhì)聯(lián)用法具有高分辨、高分離能力且靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但儀器設(shè)備昂貴 ， 難以普及 。 具有分離效果好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、分析速度快和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛采用。結(jié)合我國(guó)豆制品行業(yè)生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)狀，采用 實(shí)驗(yàn)的可操作性、檢測(cè)成本費(fèi)用、 應(yīng)用的廣泛性 等幾方面的 問(wèn)題綜合考慮較為實(shí)際，且本標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定方法與其他 有同時(shí)測(cè)定 12種大豆異黃酮單體的含量 的優(yōu)點(diǎn) 。 2、 本標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家大 豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心加工研究室）方法： 標(biāo)準(zhǔn)品制備 ：準(zhǔn)確稱取 1 準(zhǔn)品置于儲(chǔ)液瓶中，以 1:1:2 的比例（體積比）向其中加入 二 甲基 亞 砜 (乙腈， 80%的甲醇溶液，充分溶液標(biāo)準(zhǔn)品，配制成 1 mg/原始溶液。單一標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：使用 80%的甲醇溶液將原始 溶液 稀釋成 100 g/單標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：等量吸取各標(biāo)準(zhǔn)品原液混合，加 80%的甲醇溶液配制成 100 g/標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液原液，并逐步稀釋配制成 1 60g/同濃度梯度溶液以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 . 樣品處理 方法是將樣品冷凍干燥制成粉末，準(zhǔn)確稱取樣品粉末，置于離心管中，按 1:10（ g： 的比例向其中加入等體積的 乙腈 和超純水，密封后充分混勻， 使用搖床在 300 r/溫下震蕩提取 2h。然后使用離心機(jī)在 6000 r/0 清液通過(guò)慢速定量濾紙進(jìn)行過(guò)濾。濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在 35 條件下蒸發(fā)至干，向其中加入 5 0%的甲醇溶液以溶解干物質(zhì)，通過(guò) m 的有機(jī)系過(guò)濾器過(guò)濾處理過(guò)后的樣品溶液，除 去不容物。在 件下冷凍保存?zhèn)溆谩?試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò) 作站進(jìn)行記錄，數(shù)據(jù)分析采用 3、本標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法 中色譜條件： 色譜柱： 5m、 4.6 250 流動(dòng)相 A：含有 酸的超純水溶液； 流動(dòng)相 B：含有 酸的乙腈溶液； 柱溫： 35 ； 進(jìn)樣量： 20 L； 檢測(cè)波長(zhǎng) ： 262 流速 ： 1.2 mL/ 4、本標(biāo)準(zhǔn)采用的方法的確定過(guò)程： 1） 對(duì)洗脫梯度的 確定 ： 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丙二?；玖夏拒蘸鸵阴；S豆黃苷非常難以分離，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的細(xì)微改變，在保證上述兩種物質(zhì)完全分離的情況下，同時(shí)也要保 證其他的單體峰很好的分離，在進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)對(duì)比 ，證明圖 1所示的洗脫梯度較為有效，對(duì) 12種異黃酮的標(biāo)品分離如圖 2所示。 圖 1 優(yōu)化后的流 動(dòng)相洗脫梯度 圖 2 標(biāo)準(zhǔn)品 譜圖 1 大豆苷； 7 丙二?；玖夏拒?； 2 黃豆黃苷； 8 乙?；S豆黃苷； 3 丙二?；蠖管?； 9 大豆苷元； 4 丙二?；S豆黃苷； 10 黃豆黃素； 5 染料木苷； 11 乙?；玖夏拒?； 6 乙?；蠖管?； 12 染料木素 2） 對(duì)流速的 確定 ：在對(duì) 12種大豆異黃酮單體進(jìn)行一次分離的同時(shí)，分別 對(duì)流動(dòng)相流速 1.2 mL/行了試驗(yàn)，結(jié)果表明： 1.2 mL/流速能夠有效的分開(kāi)各種大豆異黃酮單體而且能夠節(jié)約單次試驗(yàn)時(shí)間。 3）對(duì)進(jìn)樣量的 確定 ：試驗(yàn)通過(guò)對(duì) 10 L 和 20 L 不 同進(jìn)樣量的對(duì)比得出：進(jìn)樣量對(duì)出峰時(shí)間以及進(jìn)樣器定量環(huán)為 20 L，為使試驗(yàn)結(jié)果更為精密可靠，試驗(yàn)采用 20 L 為進(jìn)樣體積。 4） 定量分析方法的建立： 通過(guò)對(duì)單一標(biāo)準(zhǔn)品的 到每一種標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間，并在混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖中找出對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。出峰的順序?yàn)榇蠖管?（ D） 、黃豆黃苷 （ 、丙二?；蠖管?（ 、丙二?；S豆黃苷 （ 、染料木苷 （ G） 、乙?；蠖管?（ 、丙二?；玖夏拒?（ 、乙?；S豆黃苷（ 、大豆苷元 （ 、黃豆黃素 （ 、乙?；玖夏拒?（ 、染料木素 （ ；出峰時(shí)間分別為： 通過(guò)對(duì)不同濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液的夠得出 12種大豆異黃酮單體濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表 1。 表 1 大豆異黃酮各組分回歸方程 5） 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)： 對(duì) 12種異黃酮組分混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行日內(nèi)穩(wěn)定性及日間穩(wěn)定性測(cè)定，本方法具有良好的精密度與較好的穩(wěn)定性，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 2。 由表 2可知：本標(biāo)準(zhǔn)方法日內(nèi)與日間穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果具有良好的精密度與較好的穩(wěn)定性。 表 2 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn) 五、 國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)情況 保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法方法 ： 標(biāo)準(zhǔn)品制備：稱取大豆苷、大豆黃苷和染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素（純度均為 上）各 4 別置于 10 量瓶中，加入二甲基亞砜至接近刻度，超聲處理 30 用二甲基亞砜定容。各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度均為 400 ?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)使用溶液配制： 8.0 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素六種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各0.2 10 量瓶中，加入等體積水，用 50%二甲基亞砜溶液定容。依同樣方法分別配制 16.0 L、 24.0 L、 32.0 、 40.0 的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。 樣品處理：固體樣品粉碎、磨細(xì)（過(guò) 80 目篩）、混勻，半固體樣品混勻，稱取樣品 g 0.5 g（精確至 用 80%甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至 50 量瓶中，加入 80%甲醇溶液至接近刻度；液體樣品：吸取混勻液體樣品 0.5 .0 50 量瓶中，加入 80%甲醇溶液至接近刻度。將上述樣品溶液用超聲波振蕩器震蕩 20 80%甲醇定容，搖勻。取樣品溶液置于離心管中，離心機(jī)離心 15 速大于 8000 r/取上清液用濾膜（孔徑為 m）過(guò)濾，收集濾液備用。 在標(biāo)準(zhǔn)品制備以及試驗(yàn)樣品處理方面本標(biāo)準(zhǔn)采用的方法相較于保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法的 優(yōu)點(diǎn)在于大豆異黃酮單體標(biāo)準(zhǔn)品使用量較少，可以節(jié)約試驗(yàn)成本，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)便 ，樣品處理方法比較統(tǒng)一，檢測(cè)結(jié)果更具有對(duì)比性。 保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法中色譜條件： 色譜柱： .6 250 度 5 m 不銹鋼色譜柱（也可使用分離效果相當(dāng)?shù)钠渌讳P鋼柱）； 流動(dòng)相 A：乙腈（色譜純）； 流動(dòng)相 B：磷酸水溶液（ ； 柱溫： 30 ； 進(jìn)樣量： 10 L； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 260 流速： 1.0 mL/ 目前國(guó)內(nèi)外與之相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)有： oy 001；國(guó)內(nèi)的保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法以及糧油檢驗(yàn) 大豆異黃酮含量測(cè)定 高效液相色譜法專門針對(duì)保健食品和糧油中異黃酮含量的測(cè)定。 3中方法均采用測(cè)定 6種標(biāo)準(zhǔn)異黃酮單體的含量來(lái) 確定大豆異黃酮的總含量。 本標(biāo)準(zhǔn)的一次測(cè)定 12種大豆異黃酮單體的 準(zhǔn)確地檢測(cè)大豆籽粒及制成品中 各 的異黃酮組分的含量 ，且 各組分濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積具有良好的線性關(guān)系（ 該方法使用樣品量較少，檢測(cè)異黃酮含量快速、準(zhǔn)確，適合大豆原料樣品和 大豆 制 食品的異黃酮含量的 分析檢測(cè)。 中國(guó)食品工業(yè)協(xié)會(huì)豆制品專業(yè)委員會(huì) 二零一 七 年 一 月 十一 日