黃酒 中 氨基酸 的 測定 方法 行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn) 編制說明 征求意見 稿 黃酒中氨基酸的 測定 方法 行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)起草工作組 二 O 一一年 二 月 一、 任務(wù)來源 根據(jù)發(fā)改辦工業(yè) 20081242 號文件下達的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)計劃任務(wù)，黃酒中氨基酸的測定方法 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院等負責(zé)起草，全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心歸口管理。 二、 制標(biāo)的原則 本標(biāo)準(zhǔn)是按照 準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則和準(zhǔn)編寫的規(guī)則 第 4 部分：化學(xué)分析方法 的要求編寫的。 三 、 標(biāo)準(zhǔn)化 方法研究 過程 本標(biāo)準(zhǔn)起草 工作組 通過查閱 大量國內(nèi)外氨基酸測定的方法，通過對各方法的特點進行對比分析，結(jié)合實驗室的條件和方法適用性，選擇 異硫氰酸苯酯（ 柱前衍生高效液相色譜法進行測定。對樣品的處理方法，衍生反應(yīng)條件、色譜分離條件等進行了優(yōu)化，通過回收率、穩(wěn)定性及精密度等一系列的研究，建立了 液相色譜法 同時進行 天冬氨酸 (谷氨酸 (絲氨酸 (甘氨酸 (組氨酸 (精氨酸 (蘇氨酸 ( 4（ 丙氨酸 (脯氨酸 (酪氨酸 (纈氨酸 (蛋氨酸 (異亮氨酸 (亮氨酸 (苯丙氨酸 (色氨酸（ 賴氨酸 ( 18 種氨基酸 分析 方法 。 本方法經(jīng)過 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院、 上海金楓酒業(yè)股份有限公司、浙江古越龍山紹興酒股份有限公司、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、 首都師范大學(xué)化學(xué)系 和中糧酒 業(yè)有限公司技術(shù)中心 等 6 家 實驗室驗證， 實驗室間的 再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 本 小于 10%。 四、 研究背景 氨基酸是一種兩性化合物 , 它的分子中既含有氨 基又含羧基 , 由于這兩種基團的強弱性不同 , 所以氨基酸既有酸性的也有堿性的 。 飲料酒中氨基酸的種類和含量是影響其風(fēng)味和衡量其營養(yǎng)質(zhì)量高低的一項重要指標(biāo) 。 黃 酒的甜度和酸度主要由糖類和有機酸決 定，而其它諸味則主要決定于游離氨基酸的組成， 黃酒中氨基酸主要來自原料及微生物的代謝作用， 氨基酸賦予了 黃 酒較高的營養(yǎng)價值 。 因此研究 黃 酒中游離氨基酸含量快速、準(zhǔn)確的測定方法， 對研究 黃 酒的營養(yǎng)價值和質(zhì)量控制具有十分重要的 意義 。 國內(nèi)外早已將氨基酸自動分析儀用于氨基酸的分析測定 , 自動化程度高，測定準(zhǔn)確，但是儀器價格昂貴，應(yīng)用的范圍 較窄； 大多數(shù)氨基酸缺乏天然的紫外或熒光吸收 , 進行化學(xué)衍生化 生成具有紫外或熒光吸收 的化合物 ，然后采用液相色譜法進行測定， 已成為氨基酸分離和分析的重要手段 .。 氨基酸 衍生化 方法可分為兩大類： （ 1） 柱后衍生法。 法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，但缺點是靈敏度不高，僅達到100且需雙波長檢測（ 440570隨后，有人用熒光胺、 用熒光檢測，靈敏度提高了三個 數(shù)量級，但其不與二級氨基酸（如脯氨酸）反應(yīng)。 （ 2） 柱前衍生法。相對柱后衍生法，柱前衍生法具有省時、儀器配置簡單的優(yōu)勢。柱前衍生的關(guān)鍵在于衍生試劑的選擇。 常用的衍生試劑有 鄰苯二甲醛 ( 9 6 異硫氰酸苯酯(。 其中 是不能與二級氨基酸直接反應(yīng)，需要用 同時與一級氨基酸和二級氨基酸反應(yīng) )來補充 ， 過多的 時它們的分離效 果不夠理想； 過多的衍生劑會對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾； 生效率較好，但是它為專利產(chǎn)品，應(yīng)用成本較高； 相比之下 異硫氰酸苯酯（ 和氨基酸和亞氨基酸均能反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物穩(wěn)定 見圖 1， 試劑的成本較低 ， 是目前氨基酸分析中具有吸引力的方法之一，因此本研究 采用 8種氨基 酸進行柱前衍生，液相色譜法進行測定。 N C S + H 2 N C H R C = 9 1 0N C H R C O 氨基酸和 五、 本標(biāo)準(zhǔn)分析條件的 優(yōu)化 1 衍生反應(yīng)條件的選擇 應(yīng)時間的確定 采用 氨基酸混 標(biāo)工作 液， 將 衍生方法中的衍生時間設(shè)定為 10， 20， 30， 45， 60上述時間衍生，進樣分析后，比較各氨基酸峰面積的變化 （ 以 ， 試驗結(jié)果表明氨基酸在 45 60 圖 2，因此本文選擇 60 衍生劑的去除和介質(zhì) 酸度 的調(diào)節(jié) 過量衍生試劑 色譜峰會有一定干擾， 去除 方法有真 空干燥和 有機溶劑 萃取，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)前者操作繁瑣， 本方法 采用正己 烷 萃取 去除 到凈化的目的 ；反應(yīng)產(chǎn)物的介質(zhì)為偏堿性介質(zhì)，對色譜的峰形和重現(xiàn)性有一定的影響， 且該產(chǎn)物在中性介質(zhì)較為穩(wěn)定，因此本 方法 采用 加入 10%乙酸，將反應(yīng)后的介質(zhì)調(diào)節(jié)為中性。 2 色譜條件的選擇 優(yōu)化 譜分離條件的優(yōu)化 18種氨基酸衍生物性質(zhì)較為接近， 尤其是 同時黃酒中存在大量干擾物質(zhì)， 如含量較高的氨根離子等也和 其 產(chǎn)物 與 此 ， 能 否有效的分離 18種氨基酸是 定量測定的重要因素 ；本研究首先選用不同 行 18種氨基酸的 測定 ，選擇對 18種氨基酸分離效果好的色譜柱， 然后 開展流動相比例的選擇 優(yōu)化 ， 對流動相 溫及離子對試劑的等因素進行了研究 ， 最終 采用梯度洗脫 的方式 ， 408種氨基酸 達到良好 分離 見圖 3，圖 4。 10 20 30 40 50 602004006008001000e a c ti o n ti m e (m i n )圖 2 反應(yīng)時間的影響 圖 3 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖 圖 4 黃酒的 色譜圖 流動相 流動相 基酸 分離度較大的 影響， 固定緩沖鹽的濃度和三乙胺的 濃度 ， 配置 個不同 主要研究了對 5組較難分離 氨基酸 分離度 的影響， 由圖 5可以看出 分離度 提高 ， 分離度 迅速 降低 ， 因此 本 研究 選擇 1)(2)(3)(4)(5)圖 5 流動相 基酸分離 的 影響（ 1） 2） 3） 4） （ 5） 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、 相關(guān)系數(shù) 及檢出限 將 18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋配置成 5個梯度混標(biāo)， 以 紫外檢測器 檢測， 以峰面積 x（ )進行回歸處理，計算線性回歸方程。結(jié)果表明 ： 18種氨基酸的濃度在 時其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) 表 1 線性關(guān)系分析 及 相關(guān)系數(shù) 序號 氨基酸 線性方程 相關(guān)系數(shù) 檢測限 (M) 1 y = 2862x+2269 R² = 2 y = 2716x+33281 R² = y = 2978² = y = 2889² = y = 2989² = y = 2680² = y = 2084x+14428 R² = y = 3388x+72428 R² = y = 3084x+12428 R² = 0 y = 3469² = 1 y = 4446x+63483 R² = 2 y = 4052x+43483 R² = 3 y = 3692² = 4 y = 3642² = 5 y = 5575² = 6 y = 3859x+10343 R² = 7 y = 3125² = 8 y = 8059x+464343 R² = 樣品加標(biāo)回收率 在 黃酒 樣品 中 加入 3種不同 濃度 氨基酸 標(biāo)樣后衍生 ， 根據(jù)氨基酸對照品的加入量計算回收率 ，測定結(jié)果見 表 2， 平均 回收率在 間 。 表 2 氨基酸的加標(biāo)回收率 (n=3) 氨基酸 名稱 黃酒加標(biāo)（ 回收率（ % ） 平均回收率（ % ） 方法的精密度試驗 （ 1） 將同一標(biāo)樣連續(xù)進樣 8次，得到 18種氨基酸峰面積的 （ 2） 對同一黃酒樣品平行衍生六次進行測定 ， 保留時間的 間， 峰面積 的 表 3， 說明 該方法 日內(nèi) 測定結(jié)果重復(fù)性，精密度較高 。 表 3 方法重復(fù)性試驗 氨基酸 保留時間 %） 峰面積 %） 氨基酸 保留時間 %） 峰面積 %） - ： 樣品中未測定出 6 樣品的穩(wěn)定性試驗 采用同一標(biāo)品進行衍生后 ， 室溫放置 8h ,24 h,36 h,48h,64相同的色譜條件下測定，進行 保留時間和峰面積 比較， 由表 4可以看出 保留時間 的 間 ， 峰面積 說明衍生物 具有較好的穩(wěn)定性 。 表 4 氨基酸 衍生物穩(wěn)定性試驗 氨基酸 保留時間 %） 峰面積 %） 氨基酸 保留時間 %） 峰面積 %） 、本方法的驗證結(jié)果 本方法經(jīng)過 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院、上海金楓酒業(yè)股份有限公司、浙江古越龍山紹興酒股份有限公司等 6 家 實驗室的進行了方法驗證 ，黃酒樣品稀釋 10 倍后，加入不同濃度的 18 種氨基酸，制備了 1#， 2#， 3#， 4#， 5#對照樣品， 驗證結(jié)果見表 5，由表可見 實驗室間的再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差本小于 10% 。 表 5 6個實驗室驗證實驗統(tǒng)計表 () 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# - - - - - - - - - - - - - - - - - - 均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 驗證單位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值