69 華 人 民 共 和 國(guó) 輕工 行 業(yè) 標(biāo) 準(zhǔn) 業(yè)用溶菌酶 擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí) （征求意見稿） 布 施 中華人民共和國(guó)工業(yè)和信息化部 發(fā)布 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)按照 本標(biāo) 準(zhǔn)由 全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心 提出并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn) 主要 起草單位： 本標(biāo)準(zhǔn) 主要 起草人： 工業(yè)用溶菌酶 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了 工業(yè)用溶菌酶 的術(shù)語(yǔ)和定義、 產(chǎn)品 分類、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸及貯存。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于從雞蛋清中提取 、 精制等工藝制得的 工業(yè)用 溶菌酶。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 601 化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備 602 化學(xué)試劑 雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 603 化學(xué)試劑 試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 3 產(chǎn)品 分類 按 產(chǎn)品狀態(tài) 分為 固體和液體 。 4 要求 官要求 應(yīng)符合表 1的 規(guī)定。 表 1 感官要求 項(xiàng) 目 要 求 固體 液體 狀 態(tài) 粉末 液態(tài) 色 澤 白色至淡黃色 淺黃色至深褐色 化要求 應(yīng)符合表 2的規(guī)定。 表 2 理化要求 項(xiàng) 目 指 標(biāo) 固體 液體 酶活力 /u/mg( 符合標(biāo)示值 水分 /% 6 灰分 /% .3 菌 作用 合格 品安全要求 應(yīng)符合 國(guó)家相關(guān) 規(guī)定。 5 試驗(yàn)方法 本方法中所用的水，在未注明其他要求時(shí)，應(yīng)符合 6682級(jí) 水的規(guī)格，所用試劑，在未注明其他規(guī)格時(shí)，均指分析純 （ 分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑 及制品，在沒有注明其它要求時(shí)，均按 601、 602、 603的規(guī)定制備。 官要求 取適量 試樣 ，在自然光線下， 觀察 試樣 的 色澤 和 狀態(tài) ， 并記錄 。 活力 法原理 溶菌酶可水解細(xì)菌的細(xì)胞壁，造成藤黃微球菌的溶解而引起溶液吸光度值的降低。 一個(gè)溶菌酶活力單位定義為 25 ， 用藤黃微球菌懸濁液在 450 劑和溶液 黃微球菌 698 或 同等分析效果 。 菌酶標(biāo)準(zhǔn)品 蛋清溶菌酶 。 .1 磷酸鹽緩沖液 （ 稱取 g 磷酸二氫鈉（ g 磷酸氫二鈉（ 2及 二胺四 乙 酸二鈉 （ 于煮沸滅菌的 水 中并 稀釋定容至 1000 整緩沖溶液 注：用小份緩沖溶液檢查 避免緩沖溶液被污染。如果需要，通過加入更多的磷酸二氫鈉溶液或磷酸氫二鈉溶液調(diào)整 緩沖液可 貯 存于冰箱一個(gè)月以上 。 物溶液 稱?。?10 15 ± 球菌，溶解于 50 ，傾斜混勻，不要晃動(dòng)。使用前，底物于 37 培養(yǎng) 30 底物溶液室溫下 可穩(wěn)定 2 h。 以磷酸鹽緩沖液調(diào)分光光度計(jì)零點(diǎn)，然后測(cè)定底物溶液的吸光度， 450 器和設(shè)備 光光度計(jì)：精度 ± 。 注：所用的器皿應(yīng)保持無(wú)菌，保證工作環(huán)境的清潔。 析步驟 樣溶液 的制備 準(zhǔn)確稱取 100 .1 樣，置于 50 量瓶中，用約 25 酸 鹽 緩沖液（ 拌溶解并稀釋定容，充分混勻。再轉(zhuǎn)移 3 述 試樣制 備 溶液至 100 量瓶中，用磷酸 鹽 緩沖液（ 拌溶解并稀釋定容 。 準(zhǔn)溶液的制備 精確稱取 50 菌酶標(biāo)準(zhǔn)品于 50 量瓶中， 用約 25 酸 鹽 緩沖液（ 拌溶解并稀釋定容，充分混勻 （ 如果需要，冷凍該溶液以備后續(xù)測(cè)定 ） 。轉(zhuǎn)移 3 述 標(biāo)準(zhǔn)制備 溶液 至 100 磷酸 鹽 緩沖液（ 拌溶 解并稀釋定容 。 定 取三份標(biāo)準(zhǔn)溶液和三份試樣溶液進(jìn)行測(cè)定。 25室溫下，將 1 色皿放入分光光度計(jì)，調(diào)整吸光度零點(diǎn)。吸 2.9 物溶液于比色皿，最初 450 吸光度應(yīng)為 3 內(nèi)初始吸光度值變化應(yīng)小于等于 ，方可開始測(cè)定。吸 0.1 準(zhǔn)溶液加入底物溶液，充分混合。記錄 3 光度值的變化，每 15 s 記錄一次吸光值。每分鐘吸光度值變化應(yīng)在 間，若不在要求范圍需調(diào)整試樣溶液的濃度。重復(fù)操作測(cè)定試樣溶液。 反應(yīng) 1 穩(wěn)定，計(jì)算時(shí)忽略最初 1 讀數(shù)。 果計(jì)算 酶活力 按式（ 1）計(jì)算，數(shù)值以 u/mg(示。 11 （ 1） 式中： 試樣的酶活力 ， 單位為 u/mg( 試樣 在 450 反應(yīng) 1 的吸光度； 試樣 在 450 反應(yīng) 3 的吸光度； m 用于分析的 試樣 制備 溶液 中的溶菌酶質(zhì)量， 單位為毫克（ ； 2 獲得 1 3 光度讀數(shù)所用的時(shí)間 ，單位為分鐘（ ； 由單位溶菌酶每分鐘引起的吸光度降低的值 。 密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值應(yīng)不超過算術(shù)平均值的 10 %。 分 按 定。 分 按 定。 5.5 儀器 和設(shè)備 酸度計(jì)：精度 備有玻璃電極和甘汞電極（或復(fù)合電極）。 析步驟 定 按儀器使用說(shuō)明書調(diào)試和校正酸度計(jì)。 用新煮沸冷卻的 水 配制 15 g/L 的溶菌酶待測(cè)液（液體產(chǎn)品直接測(cè)定） 。 用水沖洗電極探頭，用濾紙輕輕吸干，將電極插入待測(cè)液中，調(diào)節(jié)溫度調(diào)節(jié)器，使儀器指示溫度與 待測(cè)液 溫度相同，穩(wěn)定后讀數(shù)。 所得結(jié)果表示至一位小數(shù)。 密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值應(yīng)不超過算術(shù)平均值的 1 %。 菌 作用 劑 和溶液 試菌 ： 金黃色葡萄球菌（ 538）、大腸埃希氏菌（ 1229） ； 蛋白胨（生化試劑） ； 脂粉（生化試劑） ； 母提取物（生化試劑）； 化鈉 ； 氫氧化鈉溶液 ； 菌生理鹽水 。 器 和設(shè)備 子天平 ； 凈工作臺(tái)； 壓滅菌鍋； 溫培養(yǎng)箱； 床； 持比濁計(jì)； 量移液器 ； 標(biāo)卡尺 養(yǎng)皿（ 90 菌槍頭盒（ 配有 10 L， 200 L， 1000 菌棉簽； 菌打孔器 種環(huán) ； 角涂布棒 ； 菌帶棉塞試管 （ 18 180 口膜 。 析步驟 培養(yǎng)基 的配制 體培養(yǎng)基： 稱取 10 g 胰蛋白胨， 5 g 酵母提取物和 10 g 氯化鈉，置于燒杯中， 加入約 600 玻璃棒 攪拌使 溶解 。 用 1 氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié) 加水定容至 1000 加入瓊脂 15 g，加熱融化 。 分裝、加塞、包扎 ， 100 高壓蒸 汽滅 菌 20 在超凈臺(tái) 中 將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿 ，每板約 20 度約 2 倒入后 水平放置，打開 塞子 ， 紫外 照射（ 10 15） 凝固后，用封口 膜 封邊，倒置放入 30 恒溫培養(yǎng)箱中， 2 d 后觀察若 無(wú) 菌落生長(zhǎng) 可 繼續(xù)進(jìn)行 試驗(yàn) ，否則需重新倒平板。 體培養(yǎng)基： 稱取 10 g 胰蛋白胨， 5 g 酵母提取物和 10 g 氯化鈉，置于燒杯中， 加入約 600 玻璃棒攪拌使 溶解 。 用 1 氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié) 水定容至 1000 分裝、加塞、包扎 ， 100 高壓蒸 汽滅 菌 20 冷卻 后置于 4 下 保存， 一周 內(nèi)使用。 試菌株活化 和 涂布 取 供試菌 置于 37水浴 解凍，不斷輕微搖動(dòng)，直至完全溶解（約 2 在無(wú)菌 環(huán)境 下，接種環(huán)在酒精 燈燒過冷卻后，直接蘸 取 已溶解 的 菌液進(jìn)行劃線，接種于 體培養(yǎng)基， 平板倒置 放入 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h。從 平板 中挑單菌于加有 5 B 液體培養(yǎng)基帶棉塞的試管（ 18 180 ，置于 37、 150 床中培養(yǎng)至 1.0 2.0 間 ，菌液保存于 4冰箱中備用。吸取 100 液涂注入培養(yǎng)皿（ 90 放置 約 5 用 三角涂布棒 涂布均勻， 5 再用封口膜封邊，倒置于 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h，保存于 4冰箱中備用。 樣溶液 的制備 取適量 試樣 溶解 于 100 菌生理鹽水 中， 移取 上述溶液 10 容至 100 到試樣溶液（要求 每毫升 試樣溶液 中 至少含有 20000 U 濃度的溶菌酶 ，否則需重新配制 ） 。 取 試樣溶液 50 觀察抑菌效果。 注 1： 用無(wú)菌生理鹽水溶解 時(shí) ， 須 將 產(chǎn)生的 泡沫全部洗至無(wú)菌生理鹽水中。 注 2：試樣溶液 嚴(yán)禁高溫消毒。 定 在超凈臺(tái)里 ， 用接種環(huán)（酒精燈 燒過 后冷卻 至室溫 ）從 4冰箱保存的供試菌株涂布 平板 中輕刮一環(huán)菌體， 于 加有 5 菌生理鹽水的試管中， 振 蕩均勻，制成菌懸液。 用 無(wú)菌生理鹽水調(diào)整濁度 ， 氏標(biāo)準(zhǔn)比濁管相同 （或者 手持比濁計(jì) 測(cè) ，相當(dāng)于 108 每毫升樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù) ） 。 制備的菌液必須在 15 使用 。 用無(wú)菌棉 簽 蘸取 供 試菌懸液， 在管壁上擠壓幾次 ， 去掉過多的菌液 后， 在 平板 培養(yǎng)基表面均勻涂抹3 次。每涂抹 1 次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 60°，最后將棉 簽 繞平板邊緣涂抹 2 圈，保證涂布均勻。 蓋好 平板 ， 室溫 下靜置 30 每種 供 試菌 設(shè)兩個(gè)重復(fù)平板 。 在超凈臺(tái) 中 用 直徑為 5 菌打孔器 （不銹鋼或玻璃管或塑料管）打孔 ， 用針頭 挑取孔內(nèi)凝膠 ，并以 酒精燈 火焰封底， 使培養(yǎng)基 與 培養(yǎng)皿充分 融合。 各 圓孔 中心之間相距 25 上，與平板的周緣 相距 15 上。 每個(gè) 平板 需要一個(gè)重復(fù)。 給每個(gè)孔標(biāo)號(hào)，每孔進(jìn)樣 50 L，同時(shí)留一孔進(jìn) 50 L 無(wú)菌生理鹽水做對(duì)照組。蓋好 平板 ，用 封口膜 封邊， 正置 放入 4冰箱中 2 h，再 倒置 放入 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 18 h 后取出，觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈大小。 測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行 ， 其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界 ， 抑菌環(huán)的 外沿 以肉眼 看不見 細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。溶菌 環(huán) 不圓時(shí)， 測(cè)定 最大及最小直徑求其平均直徑。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑 （ 包 括孔洞 ） 并記錄。試驗(yàn)結(jié)果取重復(fù) 2 次的平均值。 對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則需要重新試驗(yàn)。 果判定 抑菌環(huán)直徑 6 為有抑菌作用； 抑菌環(huán)直徑 6 為無(wú)抑菌作用。 2 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用，判為合格。 6 檢驗(yàn)規(guī)則 批 同 一班次 、同 一 工藝 、 同一包裝線當(dāng)天包裝出廠（或入庫(kù)的），質(zhì)量均一的產(chǎn)品為一批。 樣 與留樣 樣 樣應(yīng)均勻分布在整個(gè)灌裝過程中，或均勻分布于灌裝后的成品中。 用適宜的方法保證取樣具有代表性，保證取樣部位和取樣瓶的清潔。對(duì)用于微生物試驗(yàn)的取樣，應(yīng)使用無(wú)菌操作。 據(jù)批量大小，按表 3 規(guī)定隨機(jī)抽取樣本，取樣總量不少于 500 g（或 500 。 表 3 糊精抽樣表 批量 /桶或箱 樣本 量 /桶或袋 50 2 51 500 3 500 4 注：批量是指批中所包含的單位商品數(shù)，單位為桶或箱。樣本量是指樣本中所包含的樣本單位數(shù)，單位為桶或袋。 樣 將樣品充分混合后置于 2 個(gè)潔凈、干燥樣品瓶中，封好。注明產(chǎn)品名稱、批號(hào)、取樣時(shí)間、取樣人姓名。一瓶化驗(yàn)，另一瓶留樣備查。 廠檢驗(yàn) 出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目為 感官、 酶活力 、 水分 （固體） 、 灰分 、 抑菌作用 。 式檢驗(yàn) 檢驗(yàn)項(xiàng)目為本標(biāo)準(zhǔn)要 求中規(guī)定的全部項(xiàng)目。一般情況下，型式檢驗(yàn)半年進(jìn)行一次。有下列情況之一時(shí)，亦應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)： a）原輔材料有較大變化時(shí)； b）更改關(guān)鍵工藝或設(shè)備時(shí)； c）新試制的產(chǎn)品或正常生產(chǎn)的產(chǎn)品停產(chǎn) 3 個(gè)月后，重新恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)； d）出廠檢驗(yàn)與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異時(shí)； e）國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)按有關(guān)規(guī)定需要抽檢時(shí)。 定規(guī)則 指標(biāo)有一項(xiàng)不合格，可加倍抽樣進(jìn)行復(fù)驗(yàn)，以復(fù)檢結(jié)果為準(zhǔn)；若復(fù)檢結(jié)果有一項(xiàng)不合格，判該批次產(chǎn)品為不合格。 7 標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、儲(chǔ)存 志 食品 用 溶菌酶 標(biāo)簽 應(yīng)符合 718的規(guī) 定。包裝儲(chǔ)運(yùn)標(biāo)識(shí)應(yīng)符合 191的規(guī)定。 裝 包裝容器應(yīng)整潔、衛(wèi)生、無(wú)破損，并應(yīng)符合相應(yīng)的規(guī)定。 輸 運(yùn)輸工具應(yīng)清潔衛(wèi)生。不得與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品混裝、混運(yùn)，應(yīng)避免受潮、受壓、暴曬。裝卸時(shí)，應(yīng)輕拿輕放，不得直接鉤扎包裝袋。 存 本品應(yīng)儲(chǔ)存在 陰涼、 干燥、清潔的倉(cāng)庫(kù)內(nèi) （ 0以下） ，嚴(yán)防日曬雨淋，嚴(yán)禁火種。不得與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品放在一起。 A _