現(xiàn)代生物科技一、基因工程1. 基因工程的誕生（1）基因工程：按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外 DNA 重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。（2）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，技術(shù)支持有基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)、工具酶的發(fā)現(xiàn)，DNA 合成和測(cè)序儀技術(shù)的發(fā)明等。2.基因工程的原理及技術(shù)(3)基因工程操作中用到了限制酶、DNA 連接酶、運(yùn)載體考點(diǎn)限制酶細(xì)化：限制酶主要從原核生物生物中分離純化出來(lái)，這種酶在原核生物中的作用是識(shí)別 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 限制酶的特性是識(shí)別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。限制酶產(chǎn)生的末端有兩種：粘性末端和平末端。 DNA 連接酶與 DNA 聚合酶的作用部位是磷酸二酯鍵，二者在作用上的區(qū)別為前者是恢復(fù)被限制性內(nèi)切酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，后者單個(gè)的核苷酸連接到DNA分子上。 作為基因工程的載體應(yīng)該具備標(biāo)記基因、多個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)、能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定存等特點(diǎn)。 常見的載體種類有質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、噬菌體（4）基因工程四步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)?？键c(diǎn)細(xì)化： 目的基因的獲取方法為根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在載體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。 基因文庫(kù)、基因組文庫(kù)、cDNA 文庫(kù)的區(qū)別：含有某種生物不同基因的許多DNA 片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌體分別含有這種生物的不同基因，稱之為基因文庫(kù)。如果含有一種生物所有基因，叫做基因組文庫(kù)。只包含一種生物的一部分基因，這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù)，如cDNA 文庫(kù)。 基因重組操作中構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是將目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 一個(gè)完整的基因表達(dá)載體包括：目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因。 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的常用方法分別是膿桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理法。 基因工程的受體細(xì)胞選擇，植物可以采用體細(xì)胞，動(dòng)物不能用體細(xì)胞，一般采用受精卵細(xì)胞。因?yàn)槭芫丫哂腥苄浴?當(dāng)受體細(xì)胞是大腸桿菌時(shí)常用Ca2+處理細(xì)胞，這樣做的目的是使細(xì)胞處于一種能夠吸收周圍環(huán)境中的DNA 分子的感受態(tài)細(xì)胞。 目的基因的檢測(cè)：轉(zhuǎn)基因生物的 DNA 是否插入了目的基因（DNA分子雜交技術(shù)）；目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA（分子雜交技術(shù)）；目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（抗原-抗體雜交）；個(gè)體生物學(xué)水平鑒定。 目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)一般需要堿基互補(bǔ)配對(duì)。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不需要堿基互補(bǔ)配對(duì)3. 基因工程的應(yīng)用（5）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上：主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力（如：抗除草劑、抗蟲、抗病、抗干旱和抗鹽堿等），以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面。（6）基因治療不是對(duì)患病基因的修復(fù)，基因檢測(cè)所用的 DNA 分子只有處理為單鏈才能與被檢測(cè)的樣品，按堿基配對(duì)原則進(jìn)行雜交。4. 蛋白質(zhì)工程（7）蛋白質(zhì)工程的本質(zhì)是通過基因改造或基因合成，對(duì)先有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造新的蛋白質(zhì)，所以被形象地稱為第二代基因工程；基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)二、克隆技術(shù)1. 植物的組織培養(yǎng)（1）細(xì)胞工程：指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過細(xì)胞水平或者細(xì)胞器水平上的操作，按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲取細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。在細(xì)胞器水平上改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，屬于細(xì)胞工程。（2）細(xì)胞全能性：具有某種生物全部遺傳信息的任何一個(gè)細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整生物體的潛能?？键c(diǎn)細(xì)化： 都具有該生物全部遺傳信息，因此從理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。 細(xì)胞在生物體內(nèi)沒有表現(xiàn)出全能性的原因是基因選擇性表達(dá)。 植物細(xì)胞的全能性得以實(shí)現(xiàn)的條件是離體，合適的營(yíng)養(yǎng)和激素，無(wú)菌操作。 在生物的所有的細(xì)胞中，受精卵細(xì)胞的全能性最高。（3）植物組織培養(yǎng)：在無(wú)菌和人工控制的條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整的植株。考點(diǎn)細(xì)化： 已分化的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞的過程叫脫分化。 再分化是愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，重新分化出根或芽等器官。 愈傷組織細(xì)胞排列疏松而無(wú)規(guī)則，高度液泡化的呈不定型狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。 植物組織培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的成分有礦質(zhì)元素、蔗糖、維生素、植物激素、有機(jī)添加物，與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比需要蔗糖、植物激素，不需要?jiǎng)游镅濉?在植物組織培養(yǎng)脫分化過程中，需要植物激素 植物組織培養(yǎng)全過程中都需要無(wú)菌，愈傷組織之前不需要光照（4）植物組織培養(yǎng)技術(shù)的用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)?？键c(diǎn)細(xì)化： 用植物體的莖尖、根尖來(lái)獲得無(wú)病毒植物人工種子中人工胚乳相當(dāng)于大豆種子的子葉，人工種子與正常種子相比發(fā)芽率高。 轉(zhuǎn)基因植物的培育需要植物組織培養(yǎng)（5）將不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體叫做植物體細(xì)胞雜交?？键c(diǎn)細(xì)化： 用纖維素酶、果膠酶去除細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體 物理方法：點(diǎn)刺激、振蕩、離心；化學(xué)方法：聚乙二醇 植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志是新細(xì)胞壁的形成 融合后的雜種細(xì)胞通過植物組織培養(yǎng)才能發(fā)育成完整的植物體（6）植物體細(xì)胞雜交這一育種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙2.動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)與體細(xì)胞克隆（7）動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞融合、生產(chǎn)單克隆抗體、胚胎移植等（8）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)過原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)考點(diǎn)細(xì)化： 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的成分有糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基固體，植物細(xì)胞培養(yǎng)基液體，培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞通常取自胚胎、幼齡動(dòng)物的組織器官 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的氣體環(huán)境是95%的空氣+5%二氧化碳的混合氣體，CO2 起到調(diào)節(jié) PH值作用 使用胰蛋白酶處理使動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞 動(dòng)物組織處理使細(xì)胞分散后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng) 貼滿瓶壁的細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細(xì)胞繼續(xù)增殖。這樣的培養(yǎng)過程通常被稱為傳代培養(yǎng)。3.細(xì)胞融合與單克隆抗體（9）動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的區(qū)別：操作步驟不同：植物原生質(zhì)體融合需要先去除細(xì)胞壁，動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁；誘導(dǎo)方法不同：動(dòng)物細(xì)胞融合可以用物理、化學(xué)和生物三種方法，植物原生質(zhì)體融合只能用物理、化學(xué)方法；最終目的不同：植物原生質(zhì)體融合最終是為了獲得雜種植株，動(dòng)物細(xì)胞融合最主要目的是獲得單克隆抗體。（10）單克隆抗體與血清抗體相比特異性強(qiáng)、靈敏度高并可大量制備（11）熟悉單克隆抗體制備過程?？键c(diǎn)細(xì)化 生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞要用B 淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合 注射相應(yīng)抗原后，從小鼠脾臟中提取出B 淋巴細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞既能大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體。 制備單克隆抗體過程中需要兩次篩選 體外條件下做大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞或者注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖，從細(xì)胞培養(yǎng)液或者小鼠腹水內(nèi)就可以提取出大量的單克隆抗體。聯(lián)想拓展：雜交瘤細(xì)胞融合時(shí)，對(duì) B 淋巴細(xì)胞為免疫過的B 淋巴細(xì)胞一種 B 細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體A 和 B 兩種細(xì)胞融合，只考慮兩兩融合，融合方式有 AA、BB、AB 融合三種制備單克隆抗體過程中需要經(jīng)過兩次篩選？第一次：特定的選擇性培養(yǎng)基。第二次：抗體檢測(cè)（13）單克隆抗體在多種人類疾病及動(dòng)植物病害的診斷和病原鑒定中發(fā)揮重要作用。主要用于癌癥治療，也有少量用于其它疾病治療。拓展：生物導(dǎo)彈中，單抗的作用是導(dǎo)向作用，能將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在位置，在原位殺死癌細(xì)胞。既不損傷正常細(xì)胞，又減少了用藥量。（14）去核卵母細(xì)胞能夠激發(fā)核的全能性，選用的卵母細(xì)胞應(yīng)該是培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期的卵母細(xì)胞（15）核移植技術(shù)獲得的動(dòng)物因?yàn)橛屑?xì)胞質(zhì)基因的影響、生活環(huán)境的差異、可能發(fā)生基因突變?cè)斐珊艘浦矂?dòng)物與供核動(dòng)物性狀不完全相同。三、胚胎工程1. 動(dòng)物胚胎發(fā)育的基本過程與胚胎工程的理論基礎(chǔ)動(dòng)物胚胎發(fā)育的基本過程：受精卵2細(xì)胞4細(xì)胞8細(xì)胞桑葚胚囊胚原腸胚胚胎工程的理論基礎(chǔ)：哺乳動(dòng)物受精和早期胚胎發(fā)育規(guī)律（1）精子和卵子的產(chǎn)生過程中精子變形，卵子沒有。卵泡的形成和在卵巢內(nèi)的儲(chǔ)備，是在出生前完成的。考點(diǎn)細(xì)化：精細(xì)胞產(chǎn)生后要經(jīng)過頂體形成、尾部發(fā)育、細(xì)胞質(zhì)濃縮最終精子形成卵子的發(fā)生在胎兒時(shí)期就完成了卵泡的形成和在卵巢內(nèi)的儲(chǔ)備，排卵前后進(jìn)行了減數(shù)第一次分裂，減分裂在精子和卵細(xì)胞結(jié)合過程中完成。（2）精、卵細(xì)胞結(jié)合前各自要發(fā)生哪些生理過程？（提示：在受精前精子要在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)獲能；排出的卵子要在輸卵管中進(jìn)一步成熟到減中期才具備受精能力）。（3）受精過程：精子獲能卵子準(zhǔn)備階段受精。卵子防止多精入卵的屏障：透明帶反應(yīng)和卵黃膜封閉作用拓展： 桑椹胚一般指 32 個(gè)左右的細(xì)胞數(shù)目的胚胎。 胚胎分割選用的胚胎最好處于桑椹胚或者囊胚時(shí)期，因?yàn)槿苄暂^高（6）胚胎工程包含的技術(shù)：體外受精技術(shù)、胚胎早期培養(yǎng)技術(shù)、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎分割技術(shù)、胚胎移植技術(shù)（7）獲得精子必須經(jīng)獲能處理后才能進(jìn)行體外受精（8）采集卵子前一般要對(duì)雌體進(jìn)行促性腺激素處理，從較大體型動(dòng)物卵巢中采集卵母細(xì)胞都要經(jīng)過體外人工培養(yǎng)成熟后，才能與獲能精子受精。（9）胚胎的早期培養(yǎng)培養(yǎng)液還需要添加激素和血清（10）獲得的早期胚胎有向受體移植、冷凍保存兩種去向2. 胚胎干細(xì)胞的移植（11）從早期胚胎或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞可以稱為胚胎干細(xì)胞（12）胚胎干細(xì)胞在形態(tài)上：體積小、細(xì)胞核大、核仁明顯；在功能上，具有發(fā)育的全能性。另外在體外培養(yǎng)的條件下，胚胎干細(xì)胞可以增殖二不發(fā)生分化。對(duì)它可以進(jìn)行冷凍保存，也可進(jìn)行遺傳改造。（13）干細(xì)胞按分化潛能可分為全能干細(xì)胞（如胚胎干細(xì)胞可以分化形成所有的成體組織細(xì)胞，甚至發(fā)育成為完整的個(gè)體）、 多能干細(xì)胞（具有多向分化的潛能，可以分化形成除自身組織細(xì)胞外的其他組織細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等）和專能干細(xì)胞（維持某一特定組織細(xì)胞的自我更新，如腸上皮干細(xì)胞）三種類型。（14）干細(xì)胞可以通過從哺乳動(dòng)物的早期胚胎（囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）或從胎兒的原始性腺中分離而來(lái)3. 胚胎工程的應(yīng)用（15）胚胎分割時(shí)要注意注意將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割。（16）胚胎移植技術(shù)包括對(duì)供、受體的選擇和處理，配種或進(jìn)行人工授精，對(duì)胚胎的收集（沖卵），檢查、培養(yǎng)或保存，對(duì)胚胎進(jìn)行移植，以及移植后的檢查等步驟考點(diǎn)細(xì)化： 胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)：a哺乳動(dòng)物發(fā)情排卵后，不論是否妊娠，在一段時(shí)間內(nèi)同種動(dòng)物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的，這為胚胎移入受體提供了相同的生理環(huán)境b早期胚胎在一定時(shí)間內(nèi)處于游離狀態(tài)，為胚胎的收集提供了可能c受體對(duì)移入子宮的外來(lái)胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能d供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯(lián)系，但移入受體的供體胚胎的遺傳特性，在孕育過程中不受任何影響。胚胎移植的實(shí)質(zhì)是生產(chǎn)胚胎的供體和孕育胚胎的受體共同繁殖后代的過程。胚胎移植的優(yōu)勢(shì)是可以充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個(gè)體的繁殖潛力。胚胎移植過程中兩次使用促性腺激素的目的是：第一次，對(duì)供體、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理；第二次，對(duì)供體母牛做超數(shù)排卵處理。胚胎移植過程產(chǎn)下的犢牛性狀取決于供體牛不同動(dòng)物其胚胎移植的時(shí)間不同，例如：牛、羊一般要培養(yǎng)到桑椹胚或囊胚階段才能進(jìn)行移植，小鼠等可在更早的階段移植。