第四章 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì),1,重點(diǎn)與難點(diǎn),熱力學(xué)相關(guān)函數(shù)：熵、焓、熱容量 蛋白質(zhì)折疊相關(guān)作用力 蛋白質(zhì)的折疊過程,2,第一節(jié) 熱力學(xué)函數(shù)與蛋白質(zhì)構(gòu)象,3,一、熱力學(xué)函數(shù)與熱力學(xué)平衡,·內(nèi)能：組成物體的所有分子的無規(guī)則運(yùn)動(dòng)的動(dòng)能與分子間相互作用的勢能之和。,4,焓(enthalpy)：是一個(gè)系統(tǒng)的熱力學(xué)參數(shù)。,它描述的是體系的一個(gè)狀態(tài)性質(zhì)，焓的變化是系統(tǒng)在等壓可逆過程中所吸收的熱量的度量。用符號H表示，即 H=E+pV E為系統(tǒng)內(nèi)能，p為其壓強(qiáng)，V則為體積,5,熵（S）是度量體系混亂度的熱力學(xué)函數(shù) 從微觀的角度來看，熵具有統(tǒng)計(jì)意義，它是體系微觀狀態(tài)數(shù)(或無序程度)的一種量度。 熵值小，對應(yīng)比較有秩序的狀態(tài) 熵值大，對應(yīng)比較無秩序的狀態(tài),6,內(nèi)能(E)和焓(H)是體系自身的性質(zhì)，要認(rèn)識(shí)它們，需憑借體系和環(huán)境間熱量和功的交換從外界的變化來推斷體系E和H的變化值。 熵也是如此，體系在一定狀態(tài)下有一定的值，當(dāng)體系發(fā)生變化時(shí)要用可逆變化過程中的熱溫熵來衡量它的變化值。,7,吉布斯自由能(Gibbs free energy,G):亦稱吉布斯函數(shù)，它是定溫定壓下系統(tǒng)的狀態(tài)函數(shù)?？梢杂霉奖硎緸椋?G=H-TS=E+pV-TS 其中，T為絕對溫度；S為體系的熵 注意:吉布斯自由能是體系的性質(zhì)，它的大小只決定于體系的始態(tài)和終態(tài)，而與變化的途徑無關(guān)(即與可逆與否無關(guān))。,8,二、熱容量,熱容量:指系統(tǒng)在某一過程中，溫度升高（或降低）1所吸收（或放出）的熱量。熱容量的單位是J/K。 系統(tǒng)的熱容量與狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程有關(guān)，與它所包含的物質(zhì)的質(zhì)量成正比，不同過程的熱容量不同。 系統(tǒng)吸收的熱量為正值，釋放的熱量為負(fù)值 使用微分掃描量熱儀直接測定熱容量變化,9,三、vant Hoff 焓, Vant Hoff 規(guī)則 ：荷蘭科學(xué)家范特霍夫 提出, 溫度每升高10 K, 反應(yīng)速度增加2-4倍,10,當(dāng)溶液中的活性狀態(tài)N與失活狀態(tài)U處于平衡時(shí)，平衡常數(shù)K=U/ N 取決于兩種自由能之差G=GUGN 。 自有能差G也可以用焓差H=HUHN和 熵差S=SUSN 表示為： G = HTS 于是： RT·lnK = H0TS0 由此看出，平衡常數(shù)對溫度的依賴關(guān)系可以用來估計(jì)H的大小。H0和S0 分別表示標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的焓和熵。 所以 lnK = H0/ RT+S0/R 即 lnK =（H0/ R）（1/T）+S0/R,11,以lnK的實(shí)驗(yàn)值對1/T作圖，可以得到一條直線，這條線上任何點(diǎn)上的斜率為 Van't Hoff焓（H0）與R之比。,Vant Hoff焓主要用于兩態(tài)轉(zhuǎn)變模型的分析,12,四、蛋白質(zhì)構(gòu)象與熱運(yùn)動(dòng),構(gòu)象:由于單鍵基本自由旋轉(zhuǎn)以及鍵角有一定的柔性，一種具有相同結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的分子在空間里可采取多種形態(tài)，分子所采取的特定形態(tài)稱為構(gòu)象。 構(gòu)象角:圍繞單鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱為構(gòu)象角,它決定了多肽鏈的一個(gè)結(jié)構(gòu) 。,13,熱運(yùn)動(dòng):是指蛋白質(zhì)溶液中所有分子的不停運(yùn)動(dòng)，包括了分子相對于容器的運(yùn)動(dòng)和分子內(nèi)部各部分之間的相對運(yùn)動(dòng)。 熱運(yùn)動(dòng)在溶液中和多肽鏈的各部分之間傳播，主要是通過多肽鏈各部分之間和多肽鏈與溶液分子之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。 體系達(dá)到熱力學(xué)平衡時(shí)，在空間的一定范圍內(nèi)和一定間隔內(nèi)的平均熱運(yùn)動(dòng)能量不再發(fā)生變化，蛋白質(zhì)處于天然態(tài) 。,14,五、熱力學(xué)參數(shù)在分子水平上的解釋,從分子的相互作用來理解蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 為了使蛋白質(zhì)折疊起來，就需要通過多肽鏈各部分間相互作用所引起的內(nèi)能的減少來抵消構(gòu)象熵減少帶來的自由能增加。,G=H-TS=E+pV-TS,15,熵是水溶液中形成疏水基團(tuán)間結(jié)合的主要熱動(dòng)力學(xué)驅(qū)動(dòng)力。,穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵、范德華力、疏水作用力和鹽鍵（離子鍵）及共價(jià)二硫鍵。,16,1靜電相互作用,蛋白質(zhì)的折疊態(tài)與退折疊態(tài)的空間結(jié)構(gòu)不同，在水溶液中，表現(xiàn)為同一個(gè)可電離基團(tuán)附近環(huán)境的有效介電常數(shù)的變化，于是它們的pka值也不同。 殘基pka值的移動(dòng)很小，但蛋白質(zhì)大分子可電離集團(tuán)相當(dāng)多，小pka值移動(dòng)的大量積累對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很重要。 靜電相互作用對折疊穩(wěn)定性潛在的重要性,17,2范德華相互作用,范德華力（van der Waals interaction） 在物質(zhì)的聚集態(tài)中，分子間存在著一種較弱的吸引力，當(dāng)兩個(gè)不帶電荷的原子非常靠近時(shí)，它們的電子云相互作用，核周圍電子位置的隨機(jī)變化可能產(chǎn)生一個(gè)瞬間電偶。該電偶能夠誘導(dǎo)鄰近的原子產(chǎn)生一個(gè)短暫的反向電偶。這兩個(gè)電偶之間會(huì)產(chǎn)生微弱的引力,從而拉近兩個(gè)原子核。這種微弱的吸引力即為范德華力 。,18,范德華力組成： 取向力 :當(dāng)極性分子相互接近時(shí)，它們的固有偶極將同 極相斥而異極相吸，定向排列，產(chǎn)生分子間的作用力 誘導(dǎo)力 :當(dāng)極性分子與非極性分子相互接近時(shí)，非極性分子在 極性分子的固有偶極作用下，發(fā)生極化，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶 極，然后誘導(dǎo)偶極與固有偶極相互吸引而產(chǎn)生分子間作 用力 色散力 :非極性分子之間，由于組成分子的正、負(fù)微粒不斷運(yùn) 動(dòng)，產(chǎn)生瞬間正、負(fù)電荷重心不重合，而出現(xiàn)瞬時(shí)偶 極。瞬時(shí)偶極之間的相互作用力 。,19,3.氫鍵（Hydrogen Bonding）,由電負(fù)性原子與氫形成的基團(tuán)如（N-H和O-H）具有很大的偶極矩，成鍵電子云分布偏向負(fù)電性大的原子，因此氫原子核周圍的電子分布就少，正電荷的氫核(質(zhì)子)就在外側(cè)裸露。這一正電荷氫核遇到另一個(gè)電負(fù)性強(qiáng)的原子時(shí)，就產(chǎn)生靜電吸引，即氫鍵。,20,在生物相中最常見的氫鍵是羥基（-OH）和氨基（-NH）之間，其穩(wěn)定性遞減次序大約是OHNXONHN-NHO，這種鍵可以發(fā)生在分子間、分子內(nèi)或者二者的結(jié)合。,21,氫鍵對蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用只能來自于水-水氫鍵+鏈內(nèi)氫鍵，和水-肽鏈氫鍵兩種情況下的自由能之差。蛋白質(zhì)中有許多種氫鍵。,22,氫鍵在蛋白折疊過程中的作用,杜克大學(xué)（Duke University）的化學(xué)家們通過改變蛋白質(zhì)關(guān)鍵部位的單個(gè)原子，發(fā)現(xiàn)了相對作用力較弱的氫鍵在使線形蛋白折疊成能發(fā)揮生物活性的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)中有重要作用,PANS,2006,23,4.疏水效應(yīng)（hydrophobic effect）,疏水效應(yīng):水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部。 蛋白質(zhì)溶液系統(tǒng)的熵增加（熵變化S為正值）是疏水作用的主要?jiǎng)恿Α?24,疏水作用是疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。要使疏水氨基酸R基團(tuán)排除水而埋在內(nèi)部，至少需要兩層二級結(jié)構(gòu)。兩種簡單形式，-環(huán)（-loop）和-角（-corner）。,25,A,B,吲哚與苯環(huán)邊對面T型接觸,惡唑環(huán)與苯環(huán)面對面平行接觸,疏水作用的方向傾斜性實(shí)例圖,26,5.二硫鍵,二硫鍵(共價(jià)鍵) 為了確定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，須在2-巰基乙醇、二硫蘇糖類、巰基乙酸等硫化合物與尿素等變性劑同時(shí)存在下將二硫鍵打開 RNA酶復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二硫鍵對肽鏈的正確折疊不是必要的，但它對穩(wěn)定折疊態(tài)結(jié)構(gòu)作出貢獻(xiàn)。,27,6.鹽橋或離子鍵,鹽橋或離子鍵又稱鹽鍵，它是正電荷與負(fù)電荷之間的一種靜電相互作用。 鹽鍵的形成既是靜電相互作用的過程也是熵增的結(jié)果。,28,第二節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊,一、體外突變技術(shù) 概念:體外突變技術(shù)是用酶學(xué)方法和化學(xué)方法剪切或合成DNA ，將突變導(dǎo)入到克隆化的基因中，再將改變的基因重新克隆到生物體中分析該基因的功能變化的一項(xiàng)技術(shù)。 分類: 隨機(jī)突變 定點(diǎn)突變 3.應(yīng)用:研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系 。,29,4.具體事例： 改進(jìn)-抗胰蛋白酶 -抗胰蛋白酶與嗜中性白細(xì)胞彈性硬蛋白酶結(jié)合形成復(fù)合物,將后者在Met358和Ser359之間切斷,30,提高重組干擾素的專一活性 - IFN 基因在E.coli中表達(dá),產(chǎn)物的抗病毒活性為天然糖基化蛋白的10% 3個(gè)Cys Cys31-Cys141 Cys17 Ser17,31,提高T4溶菌酶的熱穩(wěn)定性,T4 溶菌酶(Cys54 -Cys97) Ile3 Cys3 -Cys97 熱穩(wěn)定性 Cys21 Cys142 穩(wěn)定性 酶活性,32,磷酸丙糖異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)改造提高其穩(wěn)定性,高溫：Asn Asp Gln Glu 失活 Asn14 、Asn78 Thr或Ile 熱穩(wěn)定性,33,二、突變與熱穩(wěn)定性,1.定點(diǎn)突變對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響 氨基酸的插入和刪除、寡聚化和脯氨酸取代這三因素可以穩(wěn)定個(gè)別嗜熱蛋白。 2.導(dǎo)致熱穩(wěn)定性的因素 堆積、寡聚化、氨基酸插入和刪除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋傾向、極性表面積、氫鍵和鹽橋 3.突變試驗(yàn)增加蛋白質(zhì)的親鹽性 例如親鹽的蘋果酸脫氫酶中的唯一的Glu替換為Arg,34,三、蛋白質(zhì)折疊,1 . 蛋白質(zhì)折疊研究的概況 蛋白質(zhì)折疊:蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并沒有生物活性，結(jié)構(gòu)決定功能，一維的線型氨基酸序列轉(zhuǎn)化為具有特征三維結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)才具有生物活性，這種自我組裝的過程被稱為蛋白質(zhì)折疊。 追蹤蛋白質(zhì)重折疊的全過程的實(shí)驗(yàn)方法： 快速核磁共振，快速光譜技術(shù)（熒光、圓二色譜）,35,蛋白質(zhì)折疊技術(shù)的研究應(yīng)當(dāng)將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究與折疊過程動(dòng)力學(xué)研究相結(jié)合以促進(jìn)對蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的認(rèn)識(shí)。 “新生肽的折疊”問題與中心法則,36,2蛋白質(zhì)折疊機(jī)制,Anfinsen經(jīng)典的“熱力學(xué)假說” 天然蛋白質(zhì)多肽鏈采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的結(jié)果，采取天然構(gòu)象的多肽鏈和它所處的一定環(huán)境條件整個(gè)系統(tǒng)的總自由能最低。蛋白質(zhì)多肽鏈折疊的過程，也就是從眾多可能的構(gòu)象中尋找系統(tǒng)自由能最低的狀態(tài)的過程。,37,Wolynes提出粗糙能量地形面的觀點(diǎn),即折疊是在一個(gè)折疊漏斗中進(jìn)行的。蛋白質(zhì)折疊的過程就象多溪流水從具有復(fù)雜地形結(jié)構(gòu)的山坡流下一樣，而不僅是一溪流水從一單個(gè)山谷中流下。 折疊的能量漏斗模型形象地描繪了折疊過程的多路徑性,圖 能量漏斗模型,38,蛋白質(zhì)折疊過程假設(shè), 肽鏈中的局部肽段先形成一些構(gòu)象單元即螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)，然后再是二級結(jié)構(gòu)的組合、排列形成蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。 首先是肽鏈內(nèi)部的疏水作用起作用，產(chǎn)生一個(gè)塌陷過程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。,39,不同的假設(shè)，都有一個(gè)所謂“熔球態(tài)”的中間狀態(tài), 熔球體：在折疊中，第一個(gè)可觀測到的中間體是未折疊多肽卷折成局部有組織的球狀態(tài)。,40,分子伴侶與蛋白質(zhì)折疊 分子伴侶的功能 (1)可調(diào)節(jié)性地阻礙多肽鏈集聚 (2)具有折疊互補(bǔ)功能,即可使已形成的蛋白質(zhì)集聚體重折疊和恢復(fù)其水溶性 (3)可以促進(jìn)折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)降解,41,“有幫助的肽鏈的自發(fā)折疊和組裝”,42,3.蛋白質(zhì)折疊研究的最新進(jìn)展,巴西圣保羅州立大學(xué),美國紐約州立石溪大學(xué),以及中科院長春應(yīng)用化學(xué)研究所電分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在之前研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了擴(kuò)散(diffusion)在蛋白折疊動(dòng)力學(xué)方面的重要作用。 擴(kuò)散系數(shù)隨著蛋白質(zhì)天然狀態(tài)折疊級數(shù)的增加而減小，這主要是由于構(gòu)造空間約束的一種緊密狀態(tài)的塌陷造成的。它改變折疊動(dòng)力學(xué)的比率和動(dòng)力學(xué)路徑。,PNAS,43,美國康奈爾大學(xué)和Scripps Research Institute的研究者發(fā)現(xiàn)：沿著肽鏈具有很多疏水基團(tuán)依賴自身折疊的位點(diǎn)，生成了小型的非極性疏水袋，蛋白質(zhì)沿著包含有非極性基團(tuán)或者含有不帶電荷分子的氨基酸鏈處開始折疊，并通過這些非極性基團(tuán)的組合進(jìn)一步折疊。,PNAS，2006,44,4.蛋白質(zhì)折疊研究意義及應(yīng)用前景,蛋白質(zhì)折疊研究意義 蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明有助于揭示生命體內(nèi)第二套遺傳密碼的理論意義。 最終闡明遺傳信息傳遞的全過程，完全建立分子生物學(xué)的中心法則。,45,應(yīng)用前景,（1）對包涵體的復(fù)性有重要幫助 （2）DNA重組和多肽合成技術(shù)的發(fā)展使我們能夠按照自己的意愿設(shè)計(jì)較長的多肽鏈 （3）深入了解蛋白質(zhì)折疊與錯(cuò)誤折疊的關(guān)系對于這些疾病的致病機(jī)制的闡明以及治療方法的尋找將大有幫助 （4）蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明是我們對于蛋白質(zhì)相互作用、配體與蛋白質(zhì)的作用等結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的基礎(chǔ) （5）提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的可靠性,46,第三節(jié) 蛋白質(zhì)折疊熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué),蛋白質(zhì)折疊內(nèi)容： （1）變性的蛋白質(zhì)或多肽鏈的折疊 （2）通過三聯(lián)密碼翻譯成的氨基酸序列鏈(新生肽鏈) 的折疊 蛋白質(zhì)折疊的研究方法 （1）X-射線晶體衍射 （2）同源模建方法 （3）從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，直接預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)？,47,一、蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)研究,Anfinsen認(rèn)為,蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)在一定條件下是熱力學(xué)最穩(wěn)定的,即通常的自由能極小的狀態(tài)。 環(huán)境條件不同，熱力學(xué)平衡移動(dòng)的方向就不同，可以向天然態(tài)方向移動(dòng)，也可以向退折疊方向移動(dòng)，就有了平衡態(tài)的折疊和退折疊轉(zhuǎn)變過程。 通過熵函數(shù)和吉布斯自由能,簡要分析蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)中所蘊(yùn)涵的熱力學(xué)基本原理,48,蛋白質(zhì)折疊研究的漏斗模型,49,1.熵效應(yīng),熵增加原理：在絕熱條件下，體系發(fā)生不可逆過程時(shí)，其熵值增大；而體系發(fā)生可逆過程時(shí)，其熵值不變；不可能發(fā)生熵值減小的過程。 疏水作用的主要?jiǎng)恿碜杂诘鞍踪|(zhì)溶液體系的熵增效應(yīng)。 例如,疏水作用是肌紅蛋白多肽鏈折疊的主要驅(qū)動(dòng)力, 使水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基隱藏在分子的內(nèi)部，其在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)方面占有突出的地位。,50,2.吉布斯自由能變化, G總=H鏈+H溶劑- TS鏈- TS溶劑 折疊態(tài)蛋白質(zhì)與伸展態(tài)相比，是一種高度有序化的結(jié)構(gòu)，因此S鏈?zhǔn)秦?fù)數(shù)，則-TS鏈為正值。 折疊態(tài)蛋白質(zhì)中疏水側(cè)鏈主要是通過范德華力彼此相互作用。 對于典型的蛋白質(zhì)來說，對折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性做出單項(xiàng)最大貢獻(xiàn)的是疏水殘基引起的S溶劑。,51,3折疊/退折疊轉(zhuǎn)變,蛋白質(zhì)折疊歸根結(jié)底取決于在某溫度（T）下折疊態(tài)（F）和伸展態(tài)（U）之間的吉布斯自由能差（G）： G=GFGU=HTS=（HFHU）T（SFSU） 在伸展態(tài)中多肽主鏈及其側(cè)鏈?zhǔn)桥c溶劑水（也稱介質(zhì)水或環(huán)境水）相互作用的，因此折疊時(shí)自由能變化（G）的任何測量必須考慮多肽鏈和溶劑兩者對焓變化（H）和熵變化（S）的貢獻(xiàn)： G總=H鏈H溶劑TS鏈TS溶劑 極性側(cè)鏈H鏈?zhǔn)钦?，而H溶劑是負(fù)值。對蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈來說，G總接近于零，對蛋白質(zhì)折疊不作實(shí)質(zhì)性的貢獻(xiàn)。,52,幾種蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)數(shù)據(jù), 在不同蛋白質(zhì)中總熵變化（S鏈+S溶劑）和總焓變化對折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性所做的貢獻(xiàn)的份額是不同的,53,折疊結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下是自由能最低的構(gòu)象，因此多肽鏈的折疊是自發(fā)過程。,54,4.量熱法與折疊過程熱力學(xué),量熱試驗(yàn)是用一種微分掃描量熱儀直接測定熱容量的變化，還可以測定焓變、熵變。,N,U,55,二、蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)研究, 蛋白質(zhì)折疊 線性多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)最終形成具有三維 結(jié)構(gòu)特征并表現(xiàn)其生物學(xué)功能的天然蛋白質(zhì)的 復(fù)雜過程。 蛋白質(zhì)折疊的步驟,56,57,1折疊動(dòng)力研究技術(shù)與方法,Levinthal puzzle：假定每個(gè)氨基酸殘基可能的構(gòu)象狀態(tài)數(shù)為j，一個(gè)有N+1個(gè)氨基酸殘基，N個(gè)肽單位的完全去折疊蛋白質(zhì)，其肽鏈可能獲得的構(gòu)象狀態(tài)數(shù)為j N。 例如j=8,一個(gè)有101個(gè)氨基酸殘基的較小的蛋白質(zhì)，其肽鏈的可能構(gòu)象狀態(tài)為8100（1089） 如果構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換速率為k，蛋白分子經(jīng)歷全部構(gòu)象的平均時(shí)間為： =（Nk）-1jN 例如：101個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)經(jīng)歷全部構(gòu)象的時(shí)間多于1066年。,58,蛋白質(zhì)的折疊不是一個(gè)隨機(jī)過程，而是通過特定的動(dòng)力學(xué)途徑達(dá)到天然構(gòu)象，即動(dòng)力學(xué)上最容易達(dá)到的構(gòu)象。,59,蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的形成,60,蛋白質(zhì)多肽鏈正確折疊原因 某些因素在蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)過程中起控制作用 。 如：I型人類胰島素生長因子（IGF-I） 枯草桿菌蛋白酶(subtilisin) 蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)控制的研究基礎(chǔ)-熱力學(xué)假說 蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究方法 測定溶液中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象 測定晶體蛋白質(zhì)分子構(gòu)象,61,測定蛋白質(zhì)構(gòu)象的各種方法,62,2.過渡態(tài),模擬的折疊過程,過渡態(tài)理論 是否適合于描述蛋白質(zhì)分子的折疊退折疊過程 ？,63,3折疊中間態(tài),(1)熔球態(tài)（molten globule） 主要特征: 天然態(tài)二級結(jié)構(gòu)，但三級結(jié)構(gòu)卻不完整； 它比天然態(tài)有較多的疏水區(qū)域暴露； 當(dāng)熔球態(tài)變性到伸展態(tài)時(shí)，溫度躍遷消失。 例如Goto等發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)酸導(dǎo)致肽鏈完全伸展時(shí)，可以得到-乳球蛋白（-Lactoglobulin）、細(xì)胞色素c（cytochromec）及去輔基肌紅蛋白（apo-Mb）的熔球態(tài)。,64,蛋白質(zhì)正確折疊過程中的阻礙,部分折疊的中間體在分子間疏水作用下而引起的聚集 脯氨酸殘基的異構(gòu)化 半胱氨酸錯(cuò)誤配對而形成的二硫鍵連接,65,折疊?。?蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒有改變，只是其結(jié)構(gòu)或者說構(gòu)象有所改變也能引起疾病。 瘋牛病 朊病毒：正常蛋白的錯(cuò)誤折疊形成的致病蛋白-朊病毒蛋白(PrP)在腦組織中累積而引起的,蛋白質(zhì)折疊病,66,67,其它常見的折疊病 老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內(nèi)障等等都是折疊病。,68,（2）快態(tài)與慢態(tài),蛋白質(zhì)退折疊態(tài)的構(gòu)象上具有多樣性: 例如牛胰核糖核酸酶在變性條件下發(fā)生退折疊，結(jié)果表明，只能觀察到兩種構(gòu)象天然態(tài)N和伸展態(tài)U，并且它們處于快速平衡中：,69,RNase的重折疊快相和慢相的雙相動(dòng)力學(xué)過程,退折疊蛋白質(zhì)中，脯氨酰異構(gòu)化是研究得較為清楚的慢反應(yīng),70,U,M,N,蛋白質(zhì)在某些變性條件下還存在平衡中的另一狀態(tài)，如-乳清蛋白。,71,（3）二硫鍵引起的中間態(tài),二硫鍵異構(gòu)酶功能 具有催化蛋白質(zhì)天然二硫鍵快速形成的能力 特異性較低可與各種不同的肽鏈結(jié)合 二硫鍵異構(gòu)酶作用機(jī)制推測 通過與肽段結(jié)合阻止了錯(cuò)誤的折疊途徑,促進(jìn)生成正確的中間物，幫助肽鏈折疊使相應(yīng)的巰基配對，從而使正確的二硫鍵得以形成，然后催化巰基的氧化或二硫鍵的異構(gòu)而形成天然二硫鍵。,72,巰基二硫鍵氧化還原酶在二硫鍵生成反應(yīng)中起著氧化劑的作用 例如： 大腸桿菌中有DsbA和DsbC蛋白，真核細(xì)胞中有二硫鍵異構(gòu)酶,73,4折疊的基本過程,折疊主要經(jīng)歷以下三種基本過程 接觸形成 螺旋-鏈環(huán)轉(zhuǎn)變 發(fā)卡（-hairpin）：是普遍存在于球狀蛋白中的一種結(jié)構(gòu)，由一條構(gòu)象伸展的多肽鏈彎曲后彼此靠近成反向平行而形成，含有10或11個(gè)氨基酸殘基，兩條等長的肽段依靠16個(gè)氫鍵連接。,74,謝謝！,75,