實(shí)驗(yàn)七血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析ppt課件
血清脂蛋白 瓊脂糖凝膠電泳分析,【目的要求】 1.掌握瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的 原理,掌握正常人血漿脂蛋白的分類。 2.熟悉瓊脂糖凝膠電泳的特點(diǎn)和操作要點(diǎn)。 3.了解電泳帶中脂蛋白顯色特點(diǎn),1,【實(shí)驗(yàn)原理】,瓊脂在化學(xué)上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物,為一種含硫酸根、帶負(fù)電荷的多糖類物質(zhì)。瓊脂是直鏈多糖,它由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖的殘基交替排列組成。 瓊脂糖主要通過氫鍵形成凝膠。電泳時(shí),因?yàn)槟z中含水量大(9899%),近似自由電泳,固體支持物的影響較少,故電泳速度快、區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團(tuán),電滲影響很小,是一種良好的電泳材料,分離效果較好。 血清中脂類物質(zhì)均與載脂蛋白結(jié)合成水溶性脂蛋白形式存在。各種脂蛋白所含載脂蛋白的種類及數(shù)量不同,因而不同脂蛋白顆粒大小相差很大。因此,以瓊脂糖凝膠為支持物,在電場(chǎng)中可使各種脂蛋白顆粒分開。 瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑(或油紅等)進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行分離。通電后,可以看到脂蛋白被分成三條區(qū)帶,從負(fù)極到正極依次為脂蛋白(最深)、前脂蛋白(最淺)及脂蛋白(比前脂蛋白略深),在原點(diǎn)處應(yīng)無乳糜微粒。,2,【實(shí)驗(yàn)器材】,1.電泳儀、電泳槽 2.載玻片 3.臺(tái)式離心機(jī),3,【實(shí)驗(yàn)操作】,1.預(yù)染血清 血清0.2ml中加蘇丹黑色液0.02ml,混合置37水浴中染色30分鐘,離心(2,000轉(zhuǎn)/分)5分鐘。 2.制備瓊脂糖凝膠板 將已配制好的0.50%瓊脂糖凝膠于水浴中加熱融化,用吸管吸取約3ml凝膠溶液澆注在載玻片上,立即放上“橋”,靜置待其凝固后,小心取下“橋”。 3.電泳 將凝膠板平行放入電泳槽中,加樣孔端置負(fù)極。用四層濾紙于巴比妥緩沖液浸濕,然后輕輕蓋貼在凝膠板兩端,濾紙的另一端則浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中。接通電源后低壓加樣,加樣完后電壓調(diào)為120130V。經(jīng)電泳3550分鐘,即可見到分離的區(qū)帶。 4.如果需要保留電泳圖譜,可將電泳后的凝膠板放入干膠機(jī)中制成干膠片。若無干膠機(jī),可用玻璃紙包好凝膠板(連同載玻片),其上平鋪多層吸水濾紙,濾紙上再壓上書等重物,吸干凝膠中的水分。也可將凝膠板先放入清水中浸泡脫鹽2小時(shí),然后放烘箱(80左右)中烘干,但應(yīng)陋隨時(shí)注意溫度的變化以及凝膠的脫水程度,以避免凝膠在脫水過程中龜裂。,4,【注意事項(xiàng)】,1.預(yù)染血清與溫度有關(guān),低溫著色慢,高溫著色快,37較為適宜。 2.澆注瓊脂糖凝膠板要盡量使厚薄均一,否則會(huì)影響脂蛋白的分離效果。 3.將凝膠板放入電泳槽中,應(yīng)切記與電力線平行、樣品端置負(fù)極、搭橋?yàn)V紙不能搭在樣品上。 4.制備干膠時(shí),要嚴(yán)控制脫水的溫度和速度,避免脫水時(shí)溫度過高、速度太快引起凝膠收縮龜裂。,5,【思考題】,1.瓊脂糖凝膠電泳有哪些操作要點(diǎn)? 2. 在不同的實(shí)驗(yàn)方法(超速離心、瓊脂糖凝膠電泳、PAGE)中,正常人血清脂蛋白如何分類,電泳后的相對(duì)位置及其與超速離心法的對(duì)應(yīng)關(guān)系? 3.各種脂蛋白的功能?為什么正常人血清脂蛋白電泳時(shí)見不到乳糜微粒區(qū)帶?,6,【正常參考值】,乳糜微粒(CM) 00 % 脂蛋白(-LP)(LDL為主) 5060 % 前脂蛋白(Pre -LP) 1325 % -脂蛋白(LP)(HDL為主) 2040 %,7,