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1、第八章,微生物制藥,本章主要內(nèi)容,第一節(jié) 微生物藥物的產(chǎn)生菌 第二節(jié) 微生物藥物產(chǎn)生菌的獲得 第三節(jié) 微生物藥物的生物合成,第一節(jié) 微生物藥物的產(chǎn)生菌,微生物產(chǎn)生的藥物以抗生素為主，還有氨基酸、酶類和維生素類等多種藥物。自從抗生素應(yīng)用于臨床以來，已報(bào)道的抗生素已有一萬種左右，每年以百計(jì)增加，已應(yīng)用于臨床的抗生素有一百多種，在人類治療和預(yù)防疾病方面作出了巨大的貢獻(xiàn)。主要應(yīng)用于抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗原蟲和抗動(dòng)植物病毒等方面。,抗生素在臨床應(yīng)用中面臨的問題,細(xì)菌耐藥性逐年增加，療效逐漸下降甚至無效，導(dǎo)致了治療感染性疾病中的嚴(yán)重問題，通過新抗篩選來解決現(xiàn)在面臨的情況。,在篩選過程中要考慮兩方面的問題

2、：,一是代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，盡可能發(fā)現(xiàn)新抗及產(chǎn)生菌； 二是代謝產(chǎn)物的活性檢測要有靈敏的檢測方法和手段。,新微生物藥物的篩選過程,,藥物的產(chǎn)生菌,細(xì)菌； 放線菌（目前發(fā)現(xiàn)的10000種左右的活性物質(zhì)中有2／3是由放線菌產(chǎn)生的）; 絲狀真菌。,,細(xì)菌，臨床應(yīng)用的由細(xì)菌產(chǎn)生的有價(jià)值的抗生素并不多，多為多肽類藥物。桿菌肽、粘菌素、多粘菌素。,,青霉素、頭孢菌素、灰黃霉素。 青霉素，β－內(nèi)酰胺類抗生素，抑制細(xì)胞壁的合成，作用于轉(zhuǎn)肽酶和羧肽酶。 灰黃霉素抑制真菌的生長，使細(xì)胞停止分裂。,,放線菌產(chǎn)生的藥物主要是抗菌藥，其次是抗腫瘤藥,（1）氨基糖苷類抗生素，臨床應(yīng)用較多廣譜抗細(xì)菌，作用機(jī)制是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合

3、成。鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素。,（2）四環(huán)類抗生素，廣譜抗細(xì)菌，抑制蛋白質(zhì)的合成，與30s小亞基結(jié)合，抑制氨酰tRNA與核糖體A的結(jié)合，阻斷肽鏈延長。四環(huán)素、金霉素、土霉素。 （3）大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，抗革蘭氏陽性細(xì)菌，支原體和衣原體。與50s大亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，阻斷蛋白質(zhì)的合成。紅霉素、螺旋霉素。,（4）紫霉素類抗生素，抗革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，結(jié)核桿菌，與30s和50s亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成的起始反應(yīng)和肽鏈延長中肽基tRNA的轉(zhuǎn)移。如紫霉素、結(jié)核放線菌素。 （5）糖肽類抗生素，抗革蘭氏陽性細(xì)菌和金黃色葡萄球菌，抑制細(xì)胞壁粘肽的合成。如萬古霉素。,（6）多烯類抗生素,作用于真菌，與細(xì)胞

4、膜中的固醇結(jié)合，膜受損，胞內(nèi)的一些物質(zhì)鉀離子、氨基酸和核苷酸外漏，影響正常代謝，細(xì)胞死亡。兩性霉素、制霉菌素。 （7）其他—利福霉素（抑制RNA聚合酶從而抑制轉(zhuǎn)錄）、氯霉素（抑制蛋白質(zhì)的合成）、磷霉素（抑制肽聚糖前體的形成）。,,第二節(jié) 微生物藥物產(chǎn)生菌的獲得,一、利用微生物生產(chǎn)藥物的優(yōu)越性 微生物分布廣，種類多，易變異，次級代謝產(chǎn)物多樣性和新穎性—微生物是具有潛在治療效用的新結(jié)構(gòu)化合物的無窮源泉。,利用微生物生產(chǎn)藥物,采集樣品——分離微生物——發(fā)酵——活性物質(zhì)篩選——活性物質(zhì)的分離純化和鑒別——臨床前藥理、臨床試驗(yàn)——開發(fā)研究,二、微生物的來源,土壤，海洋，河，湖，極端環(huán)境和枯樹葉，堆肥。,

5、三、土壤微生物的分離,（一）、采集樣品 不同來源的土壤中，微生物的種類和數(shù)量有很大的差異，含有機(jī)氮較多的中性土中，放線菌和細(xì)菌較多。 含有機(jī)氮較少的酸性土中，真菌較多。 0－40厘米深處土壤中微生物的垂直分布： 真菌，地表0－0.3米；放線菌和細(xì)菌，0－1米，80％在0－10厘米。,采樣，5厘米以下，未開墾土地為佳，不同地理和生態(tài)環(huán)境，不同植被或不同質(zhì)土壤對放線菌的種類，數(shù)量影響較大，南方放線菌種類比北方多，適宜季節(jié)為春秋季。,（二）、分離,1、樣品的處理 溫度：40－100度，高溫處理，得到不同種類放線菌。 化學(xué)試劑：SDS－酵母浸膏，減少細(xì)菌55－90％，將風(fēng)干土壤與碳酸鈣26度培養(yǎng)7－9

6、天，再分離，放線菌數(shù)量增加100倍。 物理：離心，16000轉(zhuǎn)，離心20分，上清液主要是放線菌的孢子，沉淀為細(xì)菌、真菌孢子。,2、分離培養(yǎng)基 高氏一號，查氏培養(yǎng)基，特殊培養(yǎng)基。 3、抑制劑的應(yīng)用 目的菌是放線菌，培養(yǎng)基中加入抗真菌的試劑，抗細(xì)菌的青霉素或鏈霉素。,4、分離方法 稀釋分離法、劃線分離法、組織分離法、干土噴射法——噴土機(jī) 5、培養(yǎng)條件 酸度，溫度，25－30度，7－14天。 6、挑選 單菌落傳斜面。,（三）、新微生物藥物的篩選,初篩： 合適培養(yǎng)基及條件利于產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物。 培養(yǎng)方式：固體，瓊脂塊轉(zhuǎn)到活性測定平皿中；液體，發(fā)酵液，測抗菌活性。,篩選模型的要求：高專一性，高選擇性，高

7、敏感性，快速反應(yīng)性，高穩(wěn)定性。 1、常利用敏感菌作檢定菌的瓊脂擴(kuò)散法； 2、抗生素耐藥突變株。 找到有某種活性的出發(fā)菌株。,復(fù)篩： 作平行樣，多次實(shí)驗(yàn)，確證其所產(chǎn)活性物質(zhì)的能力和穩(wěn)定性。,（四）、生產(chǎn)菌的改良,1、自然選育：對于退化、產(chǎn)量下降，菌種不純等現(xiàn)象，常進(jìn)行自然選育進(jìn)行純化。 2、誘變選育：誘變劑有物理和化學(xué)兩類，物理誘變劑常為紫外線、X射線，激光等；化學(xué)誘變劑主要是烷化劑、堿基類似物等。,3、雜交育種：優(yōu)良性狀的集中體現(xiàn)，原生質(zhì)體融合——遺傳物質(zhì)的交換重組，再生后得到正常菌株。 4、基因工程改良菌種：目的基因，載體，重組體，產(chǎn)量增加。,第三節(jié) 微生物藥物的生物合成,（一）、微生物的代

8、謝 微生物代謝是指微生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)（包括合成和分解代謝）。 根據(jù)微生物在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在機(jī)體的不同作用，可分為初級和次級代謝物。,初級代謝物——使?fàn)I養(yǎng)物轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對機(jī)體具有生理活性作用的物質(zhì)。包括供機(jī)體進(jìn)行生物合成的各種小分子單體，前體和多聚物。如酶、氨基酸等。,次級代謝物——存在于某些生物中（植物和微生物），并在一定的生長期內(nèi)出現(xiàn)的一類代謝類型，對基本生命活動(dòng)幾乎無作用，產(chǎn)量較低，但他們在抵抗惡劣環(huán)境，偽裝躲避，消除自身毒素等方面發(fā)揮作用.次級產(chǎn)物的合成途徑和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通常是錯(cuò)綜復(fù)雜、各不相同的，如抗生素、酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、生長調(diào)節(jié)劑等。,（二）、次級代謝產(chǎn)

9、物生物合成的基本特征,微生物藥物是指由微生物在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的具有生理活性的次級產(chǎn)物及其衍生物。包括：抗微生物感染和抗腫瘤的抗生素；酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑、抗氧化劑。,次級產(chǎn)物合成的基本特征,1、微生物的次級代謝是微生物生理、生化狀態(tài)的體現(xiàn)，生長后期開始形成，當(dāng)培養(yǎng)液中缺乏某種重要的營養(yǎng)物質(zhì)而使細(xì)胞生長繁殖受到限制時(shí)，合成才啟動(dòng)； 2、以初級產(chǎn)物為前體，受初級調(diào)節(jié)，初級受阻，次級也不能合成；,3、一種底物可合成多種結(jié)構(gòu)上完全不同的次級產(chǎn)物，不同微生物可合成相同的產(chǎn)物； 4、合成次級產(chǎn)物的酶系對底物的特異性不強(qiáng)，進(jìn)行次級代謝的產(chǎn)生菌往往同時(shí)合成多種結(jié)構(gòu)相似的次級產(chǎn)物； 5、次級合成過

10、程中，有時(shí)控制次級產(chǎn)物合成的基因不僅位于染色體上，也可位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒易缺失，次級產(chǎn)物合成不穩(wěn)定。,（三）、微生物藥物生物合成的基本途徑,1、次級產(chǎn)物的生源 次級產(chǎn)物中的構(gòu)建單位稱之為生源（biogen），一般直接或間接來源于代謝中間物或初級代謝物，可直接作為合成的前體，也可修飾之后用于合成次級產(chǎn)物，雖然次級代謝產(chǎn)物種類繁多，但生源只有幾種。,（1）、聚酮體 （2）、糖類 （3）、氨基酸 （4）、非核酸類的嘌呤、嘧啶堿基 （5）、莽草酸 （6）、甲羥戊酸,,（1）、聚酮體,含有多個(gè)羥基，基本單元為乙酸、丁酸、丙酮、乙酰輔酶a、丙酰輔酶A等，縮合脫羥最終形成β－多酮次甲基鏈，在該生源的基礎(chǔ)上可

11、得到四環(huán)素、蒽環(huán)類抗生素，環(huán)化后可生成大內(nèi)酯環(huán)，不飽和多烯大環(huán)內(nèi)酯。,,（2）、糖類,次級產(chǎn)物，氨基糖、糖胺、核糖、環(huán)多醇、氨基環(huán)多醇。 1）、氨基糖：新霉素B，多烯大環(huán)內(nèi)酯類； 2）、糖胺：大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）； 3）、環(huán)多醇：鏈霉素。,,（3）、氨基酸,次級代謝產(chǎn)物中的多種非蛋白質(zhì)氨基酸常用來合成肽類抗生素。短桿菌肽，桿菌肽， 不常見氨基酸：L－鳥氨酸，D－苯氨酸、D－谷氨酸等。,,（4）、非核酸類的嘌呤、嘧啶堿基,次級代謝產(chǎn)物中的非核酸的嘌呤堿基和嘧啶堿基是正常堿基經(jīng)過修飾后得到的。 可用于合成核苷酸類抗生素，如嘧啶核苷酸類抗生素。,,（5）、莽草酸,源自葡萄糖。 是許多芳香族化合物和某些多酚類化合物的前體。 如利福霉素。,,（6）、甲羥戊酸,由乙酸代謝產(chǎn)生。 是異戊二烯類或萜類次級代謝產(chǎn)物的重要構(gòu)建單位。 可用于合成赤霉素，生物堿，甾體，胡蘿卜素。,,2、次級代謝產(chǎn)物生物合成的 基本途徑,包括三個(gè)主要的途徑： （1）、前體聚合 （2）、修飾 （3）、不同組分的裝配,,短桿菌肽的合成途徑,,四環(huán)素的合成,,新生霉素的合成,,第四節(jié) 抗生素生產(chǎn)實(shí)例,以青霉素的生產(chǎn)為例。 菌種：產(chǎn)黃青霉，按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)，可分為球狀菌和絲狀菌。,發(fā)酵工藝,