專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),課題3 血紅蛋白的提取和分離,1,(一）蛋白質(zhì),占細(xì)胞干重的50以上，細(xì)胞中含量最多的有機物,2、組成元素,C、H、O、N,一、基礎(chǔ)知識,1、含量,3、相對分子質(zhì)量,高分子化合物,2,4、基本組成單位,氨基酸,5、氨基酸通式,6、氨基酸連接方式,脫水縮合,3,8、分子結(jié)構(gòu),7、肽鍵,4,10、生理功能,細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動的主要承擔(dān)者,氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別,9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性,5,氨基酸間脫水縮合時，原來的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個氨基，另一端只有一個羧基（不計R基上的氨基和羧基）。所以對于一條多肽鏈說，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個,若有個n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成n - m個肽鍵,脫去個n - m個水分子，至有氨基和 羧基各m個,11、相關(guān)計算,6,蛋白質(zhì)可以含有一條或n條肽鏈、肽鏈通過化學(xué)鍵（如二硫鍵）互相連接，具有不同的空間結(jié)構(gòu),關(guān)于蛋白質(zhì)相對分子量的計算： n 個氨基酸形成m條肽鏈，每個氨基酸的平均相對質(zhì)量為a,那么由此形成的蛋白質(zhì)的相對分子量為n ·a - (n - m) ·18,7,1、分離生物大分子的基本思路,選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,2、 蛋白質(zhì)分離和提取的原理,根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì),(二）蛋白質(zhì)的提取,8,3、高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？,變性、變性、空間結(jié)構(gòu),4、人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白,9,（三） 凝膠色譜法,實例：葡聚糖、瓊脂糖,3、凝膠,1、別名：分配色譜法,性質(zhì)：一些微小多孔的球體，內(nèi)含許多貫穿的通道,2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離,10,大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道,4、凝膠色譜法的原理分子篩效應(yīng),分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離,當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢,11,5、具體過程,蛋白質(zhì)分子量的大小,4、依據(jù)的特性,12,13,（四）緩沖溶液,1、概念,在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液,能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的PH值的影響，維持PH基本不變,2、作用,14,4、緩沖溶液的組分分類,弱酸和弱酸鹽組合,3、緩沖溶液的配制,通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液,15,弱堿和弱堿鹽,多元弱酸的酸式鹽和其他所對應(yīng)的次級鹽,16,思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性),17,（五）電泳：,1、概念,帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程,2、原理,在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動,許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電,18,電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離,19,3、類型,瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳,4、實例,由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量,應(yīng)用,聚丙稀酰胺凝膠,20,21,22,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素,原理, SDS作用,為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入SDS,23,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小, SDS作用機理,24,討論：如何測定蛋白質(zhì)的分子量？,使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售.,25,二、實驗操作,樣品處理粗分離純化純度鑒定,1、樣品處理,（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟,(1)血液組成,（二）操作過程,26,成分,27,每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色,組成及作用,本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白,選材,28,29,(2)紅細(xì)胞的洗滌,洗滌紅細(xì)胞目的,除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少,洗滌操作,A、采集血樣,B、低速短時間離心（速度越高和時間越長會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果）,30,C、吸取血漿：上層透明的黃色血漿,D、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌,E、低速離心（低速短時間）,F、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈,31,(3)血紅蛋白的釋放,加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白,(4)分離血紅蛋白溶液,過程,將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min,32,第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）,第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）,第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）,第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）,試管中溶液層次,33,用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體,分離,34,取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時,(5)透析,除去樣品中分子量較小的雜質(zhì),過程,透析目的,35,36,2、凝膠色譜,（1）凝膠色譜柱的制作,取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平,底塞的制作：,37,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底,注意事項：,安裝其他附屬結(jié)構(gòu),頂塞的制作,組裝,將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體,38,39,（2）凝膠色譜柱的裝填,凝膠的選擇,A、材料,“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍,75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克,B、代表意義：,交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）,40,配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液,凝膠的前處理,凝膠色譜柱的裝填方法,A、固定,B、裝填,將色譜柱處置固定在支架上,將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻,41,注意：,2、裝填凝膠柱時不得氣泡存在：,因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果,1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙,42,43,1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果,注意：,2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象,裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm 高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時,洗滌平衡,44,（3）樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面,滴加透析樣品,吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面,打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關(guān)閉出口,45,46,樣品滲入凝膠床,洗脫,加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口,小心加入pH為7的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫,收集：,待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）,47,討論：,答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能,注意：正確的加樣操作,1、不要觸及破壞凝膠面,2、貼壁加樣,3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動,1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？,48,2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點？這一特點對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？,答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。,49,血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定,3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？,50,（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,2、試劑的配制,丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺: 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液,十二烷基硫酸鈉（SDS）: 用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存,鑒定血紅蛋白純度,1、目的,51,用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液, TEMED ：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合,用去離子水配制10% 過硫酸銨：作用提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液,Tris甘氨酸電泳緩沖液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS,52,樣品處理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油,脫色液 10%的甲醇和10%的冰醋酸,染色液 0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸,53,1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行,注意事項：,2、TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命,3、在進(jìn)行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。操作時要戴好一次性手套,54, SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備,（1）根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝膠制備,用去離子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris緩沖液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的過硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高23 mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液,3、電泳方法步驟,55,用去離子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris緩沖液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的過硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個操作過程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合,分離膠聚合完全后（約30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水,（3）樣品處理,配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液,56,（5）加樣,在電泳樣品中按11體積比加入樣品處理液，在100 溫度下加熱3 min，以使蛋白質(zhì)變性,按順序加樣，加樣量通常為1025 L。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品,（4）濃縮膠聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。,57,將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8 V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15 V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源,（6）電泳,（7）剝膠,從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位,58,（8）染色,將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1-2 h,染色完畢，傾出染色液,換脫色液脫色3-10 h，其間需多次更換脫色液至背景清楚,（9）脫色,（10）觀察結(jié)果,SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度,59,觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實驗結(jié)果分析與評價,1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,60,由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,61,如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。,3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？,62,