課題1 菊花的組織培養(yǎng),學(xué)習(xí)目標(biāo) 熟悉植物組織培養(yǎng)的基本過程。 理解細(xì)胞分化、脫分化及再分化概念。 課題重點與難點 課題重點：植物組織培養(yǎng)的基本過程。 課題難點：植物組織培養(yǎng)過程中使用的無菌技術(shù)。細(xì)胞分化，脫分化，再分化。,細(xì)胞分化：,個體發(fā)育中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和 生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。,特定時空下基因的選擇性表達(dá)。,形成各種組織器官。,結(jié)果：,原因：,定義：,？什么是細(xì)胞分化？細(xì)胞分化的原因和結(jié)果？,一、基礎(chǔ)知識,(一)植物的組織培養(yǎng)的基本過程,2.脫分化、再分化？愈傷組織（形成的？特點？）,愈傷組織是通過細(xì)胞分裂形成的，其細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。,脫分化：由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程。,再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫再分化。,2.植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)：,細(xì)胞全能性：具有某種生物全套遺傳信息的任何一個活細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整個體的能力，即每個生物細(xì)胞都具有全能性。,細(xì)胞全能性表達(dá)條件：,2.一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件,1.外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官,二、植物組織培養(yǎng)的基本過程,離體器官、組織或細(xì)胞,脫分化,愈傷組織,再分化,叢芽、根,植物體,三、影響植物組織培養(yǎng)的因素?,不同植物的組織培養(yǎng)難度不同 同一種植物的不同組織培養(yǎng)難度不同,大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co 有機物：甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等 植物激素：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等,1、外植體的選取,2、培養(yǎng)基的配制(MS培養(yǎng)基),菊花組織培養(yǎng)應(yīng)注意的問題？,討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無機鹽； 蔗糖提供碳源，同時能夠維持細(xì)胞的滲透壓； 甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞對特殊營養(yǎng)的需求。 微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)。,3、不同植物激素濃度，使用順序和使用量,4、消毒 在培養(yǎng)的整個過程中，都需要是一個無菌環(huán)境原因：,5、pH、溫度、光照 菊花： pH=5.8 溫度控制在1822 每日光照12h,活動： 用自己的話把菊花組織培養(yǎng)的操作流程給描述出來?（提示：怎樣配制MS培養(yǎng)基?外植體消毒應(yīng)如何進(jìn)行?接種、培養(yǎng)、移栽時應(yīng)注意什么問題? ）,制備MS固體培養(yǎng)基,外植體消毒,接種,培 養(yǎng),栽 培,四、實驗操作,移 栽,沖洗酒精無菌水沖洗氯化汞無菌水沖洗至少三次之上,二、實驗操作,（一）制備MS固體培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備,1、配置各種母液,無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存,激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨配制成母液,用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量,2、配置培養(yǎng)基,定容, 調(diào)PH,培養(yǎng)基的分裝,3、滅菌,分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝,（二）外植體消毒,2、消毒,流水沖洗,菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右, 酒精處理無菌水沖洗,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70的酒精中搖動23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗,氯化汞無菌水沖洗至少三次之上,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液,（三）接種,1、接種室消毒,2、無菌操作要求,操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。,3、材料的切取和接種,污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒， 酒精或新潔爾滅擦洗工作臺并用紫外線照射20分鐘,4、接種注意事項,每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種,外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜34塊，菊的莖或葉68塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件,插入時應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分,（四）培養(yǎng),無菌箱中培養(yǎng)，定期消毒，保持適宜的溫度，光照,（五）移栽,（六）栽培,幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花,移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日,1、打開封口膜,2、清洗轉(zhuǎn)移,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間,珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培,三、課題延伸,1、一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物，也容易進(jìn)行組織培養(yǎng),2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季,思 考,？,在整個操作過程中，是如何來實現(xiàn)無菌環(huán)境的？,1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌） 2、外植體的消毒（酒精、氯化汞） 3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈灼燒） 4、無菌箱中的培養(yǎng)； 5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。,結(jié)果分析與評價,（一）對接種操作中污染情況的分析 （二）是否完成了對植物組織的脫分化和再 分化 （三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計、對照與記錄 （四）生根苗的移栽是否合格,總結(jié)植物組織培養(yǎng)過程:,離體組織或細(xì)胞,植物體,細(xì)胞分裂素生長素,愈傷組織,芽,根,細(xì)胞分裂素>生長素,細(xì)胞分裂素<生長素,植物細(xì)胞培養(yǎng),不需要光,需要光,基礎(chǔ)知識,（一）植物組織培養(yǎng)的基本過程,植物的組織培養(yǎng)技術(shù),不同的植物組織 同一植物的不同材料 營養(yǎng)、環(huán)境條件 植物激素,（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素,1.制備MS固體培養(yǎng)基 1.1、配制母液 1.2、配制培養(yǎng)基 1.3、滅菌 2.外植體消毒 3.接種 4.培養(yǎng) 5.移栽 6.栽培,實驗操作,本課題內(nèi)容小結(jié),菊花組織培養(yǎng),基礎(chǔ)知識,實驗操作,植物體的組織培養(yǎng),影響組織培養(yǎng)的因素,細(xì)胞分化 細(xì)胞全能性 組織培養(yǎng)過程,營養(yǎng) 激素 環(huán)境條件,MS固體培養(yǎng)基制備 外植體消毒 接種 培養(yǎng) 移栽 栽培,思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實驗嗎？,答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。,