第2節(jié) 蛋白質(zhì)的提取和分離,1.簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)提取的基本過(guò)程和方法。 2.記住電泳法等分離蛋白質(zhì)的基本原理。,一,二,一、同工酶以及乳酸脫氫酶 1.同工酶 指催化相同的化學(xué)反應(yīng),而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。 2.乳酸脫氫酶 (1)種類:一般含有5種同工酶。 (2)特點(diǎn):相對(duì)分子質(zhì)量相同,但所帶電荷不同,電泳結(jié)果應(yīng)該形成5個(gè)條帶。,一,二,二、乳酸脫氫酶同工酶的提取和分離 1.提取原理 乳酸脫氫酶同工酶可以與特定的底物進(jìn)行反應(yīng),形成特殊的藍(lán)紫色產(chǎn)物。同工酶檢測(cè)必須依靠其具有催化活性的特點(diǎn),從而使其和其他的可溶性蛋白質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此在提取此類蛋白質(zhì)時(shí)必須提供必要的緩沖系統(tǒng)和低溫環(huán)境以保持其生物活性。,一,二,2.分離原理 蛋白質(zhì)在立體網(wǎng)狀的瓊脂糖凝膠中電泳時(shí),其遷移率主要取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。因此,乳酸脫氫酶同工酶可以通過(guò)電泳分開(kāi)。 思考： 可否利用蛋白質(zhì)的提取與分離技術(shù)快速診斷早期癌變? 提示:可以。只需從早期患者的尿液、血液或細(xì)胞裂解液中提取少量蛋白質(zhì)樣品,采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),就可以更加快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞癌變作出診斷。 3.實(shí)驗(yàn)步驟 (1)提取過(guò)程:制備勻漿獲取酶。 (2)分離過(guò)程:制瓊脂糖凝膠電泳板加樣、電泳染色、觀察。,1.蛋白質(zhì)分離提純技術(shù) 將生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)提取出來(lái)并加以分離,就可以得到高純度的,甚至是單一種類的蛋白質(zhì)。 目前常用的蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)包括離心技術(shù)、層析技術(shù)和電泳技術(shù)等。其中,電泳技術(shù)最為快捷靈敏、簡(jiǎn)便易行。 蛋白質(zhì)含有游離的氨基和羧基,是兩性電解質(zhì),在一定pH條件下帶有電荷。作為帶電粒子,蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中可以向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng),這就是電泳現(xiàn)象。蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多,移動(dòng)得越快;電荷數(shù)相同時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量越小,則移動(dòng)越快。這就是利用電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)的原理。,2.聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳需要支持物,常用的是聚丙烯酰胺凝膠,由此而來(lái)的技術(shù)稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳,簡(jiǎn)稱PAGE。 不同蛋白質(zhì)的混合溶液,在經(jīng)過(guò)同一個(gè)電場(chǎng)電泳后,會(huì)在凝膠上形成不同的帶紋。每一種帶紋可能就是一種蛋白質(zhì)。如果要對(duì)每一個(gè)帶紋做進(jìn)一步的研究,只需將這些帶紋一個(gè)一個(gè)地剪下來(lái),分別予以洗脫,然后對(duì)洗脫液中的蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的分離。如果待測(cè)洗脫液不能再分離,則這個(gè)帶紋中很可能只含有一種單純蛋白質(zhì)。如果待測(cè)洗脫液還能再分離,則這個(gè)帶紋中含有多種蛋白質(zhì),需要進(jìn)一步分離,直至提純。,3.用凝膠色譜法分離血紅蛋白的過(guò)程 凝膠色譜法也稱分配色譜法,是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由多糖類化合物構(gòu)成的微小多孔球體,在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)速度不同。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動(dòng),路程較短,移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 凝膠色譜的操作:第一步要制作凝膠色譜柱。第二步要裝填凝膠色譜柱,因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大,所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí),不得有氣泡存在,因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果。第三步是樣品的加入和洗脫。,特別提醒不是所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都用同一種方法,蛋白質(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)不同,分離方法差別很大。,4.緩沖溶液 在一定范圍內(nèi),能對(duì)抗少量外來(lái)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或具有稍加稀釋不引起溶液pH明顯變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一種或兩種化合物(緩沖劑)溶解于水中制得的,調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH基本不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是在精確的pH下進(jìn)行的,受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境,就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程有與體內(nèi)過(guò)程相同的pH。,題型一,題型二,電泳技術(shù)的原理與操作 【例題1】 下列關(guān)于電泳的說(shuō)法,不正確的是( ) A.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程 B.帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) C.蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少 D.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子相對(duì)質(zhì)量的大小 解析:蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小和形狀等因素。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物,SDS 所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異,使電泳遷移率完全取決于分子相對(duì)質(zhì)量的大小。 答案:C,題型一,題型二,反思領(lǐng)悟電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)不同以及分子本身的大小、形狀不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,題型一,題型二,蛋白質(zhì)的提取和分離 【例題2】 以下關(guān)于豬血紅蛋白提純的描述,不正確的是 ( ) A.洗滌紅細(xì)胞時(shí),使用生理鹽水可防止紅細(xì)胞破裂 B.豬成熟紅細(xì)胞中缺少細(xì)胞器和細(xì)胞核,提純時(shí)雜蛋白較少 C.血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過(guò)程的監(jiān)測(cè) D.在凝膠色譜法分離過(guò)程中,血紅蛋白比相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜蛋白移動(dòng)慢 解析:凝膠色譜法分離時(shí),大分子物質(zhì)由于分子直徑較大,不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔,而只能分布于凝膠顆粒之間,所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快,相反,相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)向下移動(dòng)速度較慢。 答案:D,1,2,3,4,5,1.電泳過(guò)程中,什么樣的分子遷移速度最快?( ) A.纖維狀、大分子 B.纖維狀、小分子 C.球狀、大分子 D.球狀、小分子 答案:D 解析:電泳就是利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同。一般來(lái)說(shuō),球狀分子比纖維狀分子移動(dòng)快,小分子比大分子移動(dòng)快。,1,2,3,4,5,2.下列說(shuō)法不正確的是( ) A.在一定范圍內(nèi),緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響,維持pH基本不變 B.緩沖溶液通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成 C.透析袋能使小分子自由進(jìn)出,而將大分子保留在袋內(nèi) D.乳酸脫氫酶一般含有4種同工酶 答案:D 解析:乳酸脫氫酶一般含有5種同工酶,其相對(duì)分子質(zhì)量相同,但所帶電荷不同。,1,2,3,4,5,3.蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是( ) A.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的特性,可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離 B.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等,可通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì) C.根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小,可通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) D.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同,可通過(guò)離心沉降法分離蛋白質(zhì) 答案:A 解析:蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜,據(jù)此可利用半透膜除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量小的雜質(zhì)。,1,2,3,4,5,4.使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過(guò)程,可表示為圖中( ) 答案:B 解析:本題考查對(duì)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理的理解。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)留在凝膠顆粒外面,相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部;相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠間隙先被洗脫,相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。,1,2,3,4,5,5.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時(shí),一定要加入緩沖溶液,其作用主要是( ) A.使酶的活力最高 B.使蛋白質(zhì)的活力最高 C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷 D.使蛋白質(zhì)帶上電荷 答案:C 解析:蛋白質(zhì)具有兩性,在一定pH下,蛋白質(zhì)分子的某些基團(tuán)會(huì)帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。因此,加緩沖溶液的目的是維持蛋白質(zhì)所帶的電荷不發(fā)生改變。,