植物總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測,植物基因組DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測,脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制備核酸時通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來使核蛋白釋放出來。植物總DNA包括細(xì)胞核DNA和細(xì)胞核外DNA,前者存在于細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。,背景知識,核酸的存在形式,DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。,核酸的理化性質(zhì),細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸,基本過程,機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；酶解法：加入溶菌酶，破壞細(xì)胞壁。,細(xì)胞破碎,SDS法SDS是有效的陰離子去垢劑,細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價鍵。CTAB法CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。,DNA提取,蛋白質(zhì)常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。RNA常選用RNase消化，或是用LiCl來消除大分子的RNA。酚類物質(zhì)提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。多糖提取液中加1PVP。,DNA純化（去雜質(zhì)）,實(shí)驗材料新鮮蔬菜葉片(去葉脈)試劑2CTAB抽提液TE緩沖液(pH=8.0)氯仿：異戊醇(24:1),材料與試劑,離心機(jī)水浴鍋研缽微量移液器,儀器用具,移液器量程的選擇,1取2g清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加1/3藥匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。2將1mL研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，置于65水浴中保溫20min，其間顛倒混勻23次。破碎細(xì)胞3.12000r/min離心5min，取上清液700L轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心5min。抽提去蛋白4將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加600L異丙醇。顛倒混勻，可見DNA絮狀沉淀。沉淀核酸512000r/min，離心1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。將沉淀回溶于20LTE緩沖液待測。,操作步驟,1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與CTAB抽提液充分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（25），盡可能選取幼嫩的材料；3）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。,注意事項,DNA分子在高于等電點(diǎn)的PH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。在一定電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。,電泳原理,瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。,儀器和試劑,儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等,Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）,常用電泳緩沖液,電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。,上樣緩沖液,溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng。,核酸染色劑,注意事項：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),不同種類DNAMarker,1.凝膠制備制備0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入20mL0.5TBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60時，加入EB至終濃度0.5g/mL。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。2.加樣取10lDNA樣液與2l上樣buffer混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。3.電泳接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為15V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）,待溴酚蘭移動到一定位置，停止電泳。4.觀察拍照,四、操作步驟,1.結(jié)合原理，簡述CTAB法分離提取植物總DNA的基本過程。2.為了獲得高質(zhì)量的植物總DNA，在分離提取過程中應(yīng)注意那些問題？,What?!How?!,思考,