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1、染色體熒光原位雜交技術,摘 要 FISH（Fluoresence In Situ Hybridization）技術是80年代開始發(fā)展起來的一種新的定位技術。在人類基因組研究中得到了廣泛的應用通過中期染色體的FISH可以進行SCP，Cosmid和YAC的染色體定位，嵌合克隆的鑒別，通過間期核的FISH可以在50kb的分辨率下進行基因作圖，最新的研究進展已可以進行伸展的染色質(zhì)絲(chromatin fibre)的FISH，直接測量基因的長度、從而達到高精度基因作圖的目的。隨著FISH技術發(fā)展，它將在人類以及其它物種基因組研究中發(fā)揮更大的作用。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光標記的染色

2、體原位雜交技術提供了一種快速而有效的手段，將DNA片段和特定的真核生物細胞的染色體區(qū)帶聯(lián)系了起來，并將這些DNA片段排序，這是研究DNA順序在染色體上位置的最直接的方法。最早，人們根據(jù)Gall和Pardue在1969年的工作，于70年代，建立起了同位素原位雜交技術，但當時只是用于DNA順序在多線染色體上的定位或是重復順序在中期染色體上的定位。1981，Gerhard和Harper等首先證明有可能將從個體基因中得到的單拷貝順序(SCP，single copy probe)通過同位素原位雜交技術定位到中期染色體上。在此基礎上，80年代初起，熒光標記的原位雜交技術開始起步并得到運用且不斷地發(fā)展起來。

3、,1、FISH技術簡介,FISH技術包括下列幾個步驟： 1、探針的準備和標記； 2、探針和染色體的雜交； 3、信號檢測； 4、雜交信號與分帶染色體的比較。,1.1 探針的準備,探針標記時可采用兩種基本方式： （1）直接標記法：將熒光分子直接標記于探針DNARNA上，雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測。這種方式快速簡捷，由于雜交信號較弱、且不能進一步放大，以前這種方法用得不多，但它有背景少的優(yōu)點，近來在一些公司的試劑盒中得到應用。,（2）間接標記法：常用的間接法是將一些類似于半抗原(hapten)的標記分子摻入探針分子中。用的較多的試劑有生物素，地谷新(digoxigenin)，二硝基苯(dinit

4、rophenyl，DNP)，氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene，AAF)，汞和磺酸鹽(sulfonate)。就摻入方式來說，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物的形式摻入的，可用切口平移法來進行?，F(xiàn)在更多的人開始用隨機引物法。用這兩種方法標記好的探針大小在200一500bp范圍內(nèi)，是用于雜交的最佳大小。另外，也可以在已知順序的兩個引物之間用PCR法來擴增，或從合適的載體上通過RNA轉(zhuǎn)錄而來。,1.2 探針和染色體的雜交,染色體原位雜交：標記后的探針經(jīng)變性后加于變性的中期染色體分裂相標本上。于37攝氏度、50的甲酰胺2XSSC條件下進行雜交最適的雜交條件主要取決于探針與靶基因的性質(zhì)。對

5、于單拷貝基因的雜交，特別是較長的來自基因組的序列，一般在雜交之前應進行預復性過程，標記的探針與過量的基因組DNA或Cot1重復序列一起孵育1小時，使探針中非特異的重復序列被封閉。從而抑制該部分探針與染色體之間發(fā)生非特異性雜交，上述過程又稱為抑制性染色體原位雜交。經(jīng)預復性之后已標記好的變性探針(200一500bP)再與變性的染色體在含有甲酰胺，鹽和醋酸葡聚糖的雜交緩沖液中雜交過夜。接著是柔和的洗滌，以去除未雜交或錯配對的探針。,1.3 信號的檢測,在洗去未雜交和錯配對的探針分子之后，載片培養(yǎng)在免疫熒光試劑中，使其在探針雜交的位置上產(chǎn)生熒光信號，偶聯(lián)了熒光素分子的抗生物素蛋白被用來標記已摻入到探針

6、分子中的生物素、地谷新、二硝基苯、AFF和磺酸鹽則可以用相應的標上了熒光素的抗免疫球蛋白來標記。 最常用的熒光素分子有FITC，rhodamine和Texas Red等。,1.4 分帶和信號定位,染色體的分帶可以在雜交前，也可以在雜交后，高分辨的染色體標本是取得好的帶形的基礎。常用的分帶方法有：G(Giemsa)帶、Q(Quinacrine)帶、R(Reverse)帶，包括色霉素chromomycin A3偏端霉素distamycin A 法；hoechst33258propidium iodide3，8二氨基53(二乙基甲基氨)丙基6苯菲碘法，DAPIDAPI：4，6diamidino，2p

7、henylindole 2HClpropidium iodide法，染色體的分帶也可以直接用AluLIHs(LI homo sapiens)或Alu之間的順序和染色體雜交而得到類似R帶的條帶，更多的人在努力使雜交信號和分帶可以同時在顯微鏡下看到。,由于雜交和分帶同時進行效果不佳，有人采用FL(fractional length)來測量。以雜交信號相對于某固定位置(如端粒)的長度占該染色體長度的比例來表示。 在不分帶的情況下，特定的染色體可以通過著絲粒特異，或端粒特異的探針進行共雜交來確定。復雜的探針族，如從一個染色體特異的DNA文庫中得來的克隆，可以用來修飾和確認染色體，稱為染色體繪圖。,影響

8、雜交結(jié)果的參數(shù)有下列幾個：探針濃度，雜交時間，探針大小，雜交溫度，染色質(zhì)變性條件，染色體的制備和硬化程度，RNase作用條件，用于降低背景的非特異性競爭DNA和醋酸酐處理其中有幾個因素影響雜交信號的強度和特異性，具體的講是DNA探針的純度；用于雜交反應的探針的大小小心掌握好這些條件，我們就能得到?jīng)]有熒光背景的特異性信號。,FISH的結(jié)果還有一個重要的方面，就是分辨率的問題。影響結(jié)果分辨率的因素有兩個，染色體上的特定位置和染色體的濃縮程度。著絲粒和端粒的變化比其他的染色體位置的變化要多，在分析結(jié)果時就比較容易辯認。特定的染色體結(jié)構(gòu)在其雜交結(jié)果的分辯率上起著重要的作用。制備染色體較伸展狀態(tài)的展片，

9、如早中期染色體或中期染色體，將會得到較高的分辯率，另外，光學系統(tǒng)的先進程度也是提高分辨率的有效手段。,2、FISH技術的優(yōu)點,首先，從探針的制備雜交來看，生物素和其他標記分子沒有放射性，標記過程和雜交過程沒有污染的危險，比較安全。而且用生物素或其他的標記分子標記好以后的探針分子相當穩(wěn)定，沒有半衰期的限制，可以長期保存。熒光顯色時間短，不象同位素雜交那樣要求長時間曝光，背景簡單。靈敏度也毫不遜色。,另外，F(xiàn)ISH可以用多種顏色同時顯色，這是同位素雜交不可比擬的。這種多色作圖，可以便染色體分帶和探針信號顯不同的顏色而同時觀察；也可以用不同熒光標記不同的探針，以確定探針在染色體上酌相對位置。,間期核

10、作圖也是FISH的一個特色，因為它常常是和多色技術結(jié)合在一起的。中期染色體的FISH的分辨率大約為1Mb，而間期核作圖的精度一般為50kb。這一精度的變化使FISH有可能直接用于基因作圖?？梢哉f間期核作圖技術是遺傳研究和脈沖電泳結(jié)果的橋梁。與遺傳圖譜不同，它不依靠多態(tài)性標志和大的家系；也不象脈沖電泳后的稀切點酶物理圖譜分析，它不依靠稀切點酶位點的存在和甲基化程度，并且不受CpG島出現(xiàn)頻率的影響。它的原理是間期核上DNA順序間的距離與線性DNA分子上該兩個順序間的距離呈對應曲線性關系。由于這些原因間期核作圖可以作為遺傳作圖和物理作圖分析的輔助結(jié)果來構(gòu)建染色體亞區(qū)的基因圖。間期細胞原位雜交還可用于

11、不能制備中期染色體的細胞的研究，如腫瘤細胞和非周期細胞。,信號擴增也是FISH所特有的。為了使雜交信號足夠強，可以進行信號擴增。擴增的方法是加上一層熒光標記的標記分子的抗體，再加上一層偶聯(lián)了標記分子的抗抗體，然后再加一層熒光標記的標記分子的抗體，形成三明治結(jié)構(gòu)以生物素標記為例，在加熒光標記的抗生物素蛋白avidin之后，加一層山羊生物素標記抗抗生物素D，然后再加一層熒光標記的抗生物素蛋白。,用于人染色體作圖的典型探針是cDNA或克隆的基因組DNA片段，大多數(shù)的cDNA由單拷貝順序組成，SCP由單拷貝的基因組順序組成。而大多數(shù)的克隆基因片段中除了單拷貝順序外還有插入重復顧序（interspers

12、ed repeatitive sequence，IRS），如A1u，據(jù)分析每35Kb就有一個A1u順序。所以在用cos質(zhì)粒和YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色體）做為探針時，就會有一些重復順序干擾單一順序產(chǎn)生特異性信號。通常將標記好的探針片段變性，與過量的非標記的競爭DNA一起復性，常用的有人總DNA或cot1DNA。這時探針中的IRS就很快地與競爭DNA中的IRS結(jié)合，剩下的是已標記了的單拷貝順序，所看到的染色體上的雜交信號就表明是單拷貝順序所在的位置，這一過程在FISH中叫做抑制性雜交。抑制性雜交的使用使FISH的應用更加廣泛，并可能在人類基因組的

13、研究中發(fā)揮其作用。,3、FISH在人類基因組研究中的應用,FISH作為確定基因片段在染色體上位置最直接的方法，在人類基因組研究中的應用日益廣泛深入。所研究的基因片段通常克隆在質(zhì)粒，phage，cosmid和YAC中，可以用FISH技術知道其在分帶染色體上的位置，也可以以此手段進行某種遺傳病的診斷。,3.1 SCP(single copy probe)的定位：,SCP的定位是染色體骨架圖構(gòu)建的主要內(nèi)容之一。當SCP用生物素標記之后，與中期染色體雜交，用免疫熒光標記的試劑檢測，就可以明確地知道某個SCP在做好分帶的中期染色體上的位置。SCP的定位是應用FISH技術進行人類基因組研究中的最簡單的一種

14、。但是太小的片段在實際工作中的難度較大。FISH不僅可使SCP直接定位于染色體上，也可以定位于間期核，為高分辨的基因作圖和核組織分析提供了有力的手段。,3.2 Cos質(zhì)粒的定位,Cos質(zhì)粒的克隆容量約為3545kb，在FISH剛開始應用時這大小是很適合于做探針的，在使用抑制性雜交之前，是先分離cos質(zhì)粒的插入片段中的單拷貝順序，然后才進行雜交。應用了抑制性雜交步驟之后一切就方便多了。1992年Fan報道了他們將50個cos質(zhì)粒克隆用FISH定位到了染色體上的結(jié)果。其中38個在X染色體上分布于長臂或短臂上，另外10個分布于中心粒上。這些結(jié)果促進了X染色體的作圖，同時分布于X和8號染色體的中心粒上

15、的那些cos質(zhì)粒，將有利于這些區(qū)域的結(jié)構(gòu)和組成的研究。1990年，Lichter等人報道，運用數(shù)字圖像技術分析cos質(zhì)粒為探針的FISH結(jié)果，所用的染色體是早中期染色體，結(jié)果和雜交細胞株系列的結(jié)果一致。當3個或3個以上的cos質(zhì)粒同時雜交時，可以得出它們在染色體上的順序。1991年，Trask報道，將2個或3個cos質(zhì)粒經(jīng)兩種不同顏色的熒光標記之后，與間期核進行雜交，由此排出了7個cos質(zhì)粒的順序，精度在50kb。,3.3 YAC的定位和YAC重疊群(contig)的構(gòu)建,YAC的容量比起cos質(zhì)粒來就更大了，最大的可達2Mb。定位YAC的方法有三種。有些探針在染色體上的位置已知(可以用FIS

16、H來定位)，而又可以肯定它在某個YAC中，那么這個YAC在染色體上的位置就確定了；YAC也可以直接進行FISH。先抽提酵母的DNA，然后脈沖電泳分離出YAC的插入片段，用此插入片段進行FISH；現(xiàn)在PCR技術越來越成熟，可以用Alu PCR法擴增YAC上的插入部分，將A1u PCR產(chǎn)物來進行FISH。在多個YAC分別定位的基礎上，或根據(jù)幾個YAC經(jīng)多色標記后同時與染色體雜交后的結(jié)果，可以按YAC間的相對位置來構(gòu)建YAC重疊群。所得的結(jié)果可通過一個YAC經(jīng)標記后與YAC庫內(nèi)的其它YAC進行雜交的結(jié)果來驗證。1991年，Montanaro報道，他們用FISH的方法定位了102個YAC。這些YAC覆

17、蓋了Xq24Xq28的50的區(qū)域。他們定位的精度是0.5帶，所以這l02個YAC就分布在9個區(qū)段內(nèi)(半條帶為一個區(qū)段)。這些結(jié)果綜合起來為YAC重疊群的構(gòu)建提供了一條道路。,,YAC DNA的FISH不僅可以為構(gòu)建YAC contig提供數(shù)據(jù)同時也可以用這一方法來檢測YAC中的嵌合(chimeric)YAC。YAC克隆可以克隆大片段的DNA，但是隨之也帶來了缺點，其中主要的一點就是嵌合DNA的出現(xiàn)。在染色體上處于不同位置的DNA片段，在克隆過程中相互連接或轉(zhuǎn)化過程中同源重組，克隆進了一個YAC，應用FISH就是可以發(fā)現(xiàn)一個YAC經(jīng)標記熒光后原位雜交可以在一個以上的染色體區(qū)域產(chǎn)生特異性信號。這是

18、發(fā)現(xiàn)嵌合YAC的最簡便而直接的方法。這對于人類基因組的研究有很重要的意義。,,定位一個克隆片段在染色體上的位置的另外一個方法是探針與雜交細胞株系列(Somatic cell hybird Panel)進行雜交，因為各個細胞株所含的人染色體區(qū)段不同，雜交結(jié)果就可以說明克隆片段在染色體上的位置。研究結(jié)果表明FISH定位的結(jié)果和雜交細胞株系列的結(jié)果一致。在今日，F(xiàn)ISH技術日趨成熟，精度越來越高的情況下，使用雜交系細胞株系列定位的人越來越少了。,FISH技術的其它應用,1細胞遺傳學的研究 （1）實體腫瘤的染色體研究比較困難，這是由于獲取足夠量的分裂期腫瘤細胞比較困難。使用染色體著絲粒特異探針，對問期

19、細胞進行染色體數(shù)量變異分析，可獲得較好的結(jié)果”。,Fig. 2. Example of the SKY analysis of metaphase chromosomes prepared from the GRANTA-519 cell line. The RGB image (A) and the DAPI-stainedchromosomes (B) are shown. Identification of chromosomes and chromosomal alterations is possible after chromosome classification. Chromo

20、somes inRGB (left) and classified colors (right) are shown in the lower panel.,Fig. 3. Multicolor banding analysis of chromosome 1 revealed an inversion in 1p that was not detectable by conventional cytogenetic analysis and SKY. This is shown on the right in comparison with a normal chromosome 1 in

21、a healthy person (left). The breakpoint in the inverted chromosome is indicated by an arrowhead.,,（2）選擇按一定順序排列的基因探針，可以幫助確定染色體倒位，尤其是臂間倒位的性質(zhì)，如急性白血病有16號染色體的倒位。,,2基因圖譜的繪制 （1）采用FISH技術，不僅可以直接確定某一DNA鏈在染色體上的位置而且應用多種顏色熒光素標記探針，還提供了一個簡單的確定基因順序的方法?？捎貌煌伾珶晒馑貥擞泝蓚€不同的DNA鏈，而且他們在染色體上的距離大于1Mbp時，可以依據(jù)不同探針信號的排列關系分辨它們在染色體

22、上的順序。 （2） 標記同一DNA鏈與不同種屬細胞的染色體雜交，可以找出不同種屬之間的同源基因以及基因在染色體上的位置，從而了解種屬之闖的進化關系。,,3基因擴增的檢測 DNA擴增通常表現(xiàn)為異常的顯帶區(qū)域(ABRS)或異染色質(zhì)區(qū)(HSRS)以及無著絲微小體(DM)，這些基因擴增的細胞遺傳學表現(xiàn)出現(xiàn)在許多惡性腫瘤中。搞清楚腫瘤細胞中特定DNA鏈(基因)的擴增，有助于了解腫瘤的惡性增生過程。惡性增生過程。在腫瘤細胞中某些腫瘤基因(Oncogene)的擴增，可作為預測腫瘤進展及預后的臨床指征。如乳腺癌細胞中Her2一nell基因的擴增常預示著患者預后較差。,4FISH技術的新進展,1993年9月，美

23、國德克薩斯州癌癥治療和研究中心的Parra和Windle報道了迄今為止精度最高的FISH。這是一種新的作圖方法，在這一技術中，雙鏈DNA完全伸展并依附在載片上，與生物素或地谷新標記的探針雜交之后，用熒光抗生物素蛋白或其它抗體檢測DNA探針在伸展的DNA鏈上的分布是可見的，并可以用熒光顯微鏡記錄下來。從這一圖象，可以作出一圖譜，稱為直視雜交DNA圖譜(direct visual hybridization DNA Map，DIRVISH)。這一作圖技術遵循這樣一個原理，一個小的DNA區(qū)域(假定為5kb)，當它伸展到一定的長度時，這是可以在顯微鏡下看見的。基于這樣的數(shù)據(jù)：對于完全伸展的雙鏈DNA來

24、講，每對堿基所占的長度為0.34nm，那么5kb的DNA長度為17m，一個40kb的cos質(zhì)粒將占136Pm，一個500kb的YAC將占據(jù)170m。在制備載片時，先將細胞固定在載片的一端，然后用去污劑消化，讓溶液中的DNA動態(tài)地流到另一端，就得到了伸展的DNA雙鏈，結(jié)合常規(guī)FISH就可以得到DIRVISH圖。這篇文章報道了他們在兩天內(nèi)做出的一個結(jié)果，一個跨度為200kb，含有五份拷貝的擴增的二氫葉酸還原酶基因的圖譜。,,在進行與疾病有關的某個基因片段的FISH時，除了與中期染色體雜交外，還以腫瘤細胞為材料。在美國，有人成功地進行了單個細胞的FISH和單個精于的FISH。更有甚者，將試管中的八細

25、胞胚胎上的一個細胞取下做FISH。再把七細胞胚胎植入體內(nèi)。,,除了在人類基因組研究中的應用之外，F(xiàn)ISH在其他方面也大有用武之地。如： 病毒檢測，應用FISH方法可以了解細胞內(nèi)的病毒是否已整合，如果整合了其取向如何，拷貝數(shù)目多少。 定量分析，用于研究表達，如mRNA在細胞中的分布及量的多少，更大而言之，可以用此方法檢測和定位某一特定核酸在組織，細胞和基因組中的分布。 在細胞分裂過程中，異質(zhì)性及其產(chǎn)生機制也可以用此法來研究。,熒光標記的原位雜交作為一項技術已經(jīng)成熟，但是它也是在不斷發(fā)展的，其應用范圍也在不斷擴大，隨著雜交試劑的商品化，F(xiàn)ISH已成為基因定位的常規(guī)而必不可少的手段。在人類基因組的研

26、究中更是越用越多，現(xiàn)在已發(fā)展到這樣的情況，每發(fā)表一個DNA片段的研究結(jié)果或每報道一個基因，就有一張相應的FISH圖。1993年，在人類基因組研究神戶會議上，有人提出，要用24種不同的顏色來標記24條不同的染色體。隨著應用的廣泛，F(xiàn)ISH也在不斷得到發(fā)展人類基因組研究新的五年計劃中提出要完全人類基因組分辨率為l00kb的STS(sequence tagged sites)圖，對于完整基因組將需要30000個STS。到目前為止我們還只有1500多個，也就是說還缺少95新的STS。每個新的STS都需要定位數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)都需要用FISH來完成。,5FISH技術展望,隨著標記手段、檢測試劑以及熒光觀察

27、等技術的發(fā)展，染色體FISH的應用范圍在不斷拓寬，激光共執(zhí)聚焦顯微技術的發(fā)展，使得核的三維重建可以在計算機的輔助下得以實現(xiàn)。染色體FISH不僅可用來定位基因，而且可用以研究基因在間核中的位置。初步的結(jié)果提示，染色體上基因的拓樸結(jié)構(gòu)，有可能影響基因的生物學功能。,人類基因計劃的進展，使得越來越多的基因需要通過染色體FISH技術加以定位。YAC克隆容量的不斷擴大，一方面使得FISH的成功率大為提高，另一方面，YAC文庫的鑒定與分析，也越來越依賴于FISH技術。近來，采用可在哺乳類細胞中復制的基因原件，構(gòu)建了哺乳類細胞人工染色體(MAC)，用來克隆更大的基因片段。MAC的發(fā)展，將為FISH展示更為廣闊的應用前景。,FISH的進一步發(fā)展，還將開發(fā)穩(wěn)定有效的方法，以定位更短的基因片段(501000bp)，使研究者們可以方便地定位來自cDNA的基因，從而大大加快物理圖譜與基因圖譜的繪制。一般認為，原位延伸FISH技術，可能是有希望的候選方法。首先使短片段探針與染色體發(fā)生結(jié)合，然后在聚合酶、dNTP、標記物以及其它條件下，原位使探針延伸、摻人標記物，再進行熒光檢測，由此，該方法又被稱為引物介導的原位標記(PRlNS)。PRINS的建立，將接通細胞遺傳學與分子遺傳學之間的鴻溝，為從染色體水平原位研究基因轉(zhuǎn)錄、重排、擴增、基因組結(jié)構(gòu)與調(diào)控等諸多分子生物學課題開辟新的途徑。,