LOREM IPSUM DOLOR,乙肝病毒DNA的實驗室檢測 袁立云,1、熒光定量PCR技術(shù) 2、乙肝病毒的感染 3、HBV-DNA與臨床,熒光定量PCR技術(shù),熒光定量PCR技術(shù),Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟在3個小時內(nèi)反復(fù)循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴增1000萬倍。 每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）,實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。,熒光定量PCR技術(shù),PCR 反應(yīng)過程,d.NTPs,Taq 酶,Primers,反應(yīng)組分,變 性,延 伸,重 復(fù),退 火,循環(huán)2 4個拷貝,循環(huán)3 8個拷貝,熒光定量PCR原理,插入染料法 SYBR Green I 雜交探針法(最常用) TaqMan,TaqMan探針,d.NTPs,Taq酶,Primers,反應(yīng)體系,變 性,l,退 火,1. 鏈取代,2. 水 解,3. 聚 合,4. 檢測熒光,l,乙肝病毒的感染,乙肝病毒的感染,（一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點,HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志 HBsAb：保護性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內(nèi)， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復(fù)制狀態(tài) HBeAg：HBV復(fù)制及強感染性的指標(biāo) HBeAb：有一定的保護作用，預(yù)后良好,乙肝病毒的感染,（二） HBV-DNA與“兩對半”,1. “兩對半” ：機體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；,2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。,FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。,3. 血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。,乙肝病毒的感染,5.HBeAg陽性標(biāo)本HBV DNA檢出率90左右 HBeAg與HBV DNA有著良好的相關(guān)性,4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。,乙肝病毒的感染,乙肝病毒的感染,慢性HBV感染分期及相關(guān)實驗室檢測指標(biāo),魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實驗室診斷研究進展 2009,HBV-DNA與臨床,HBV DNA檢測的臨床意義,HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志 HBV DNA對乙肝兩對半起補充作用 HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo) HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎,有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷,提供直接證據(jù)縮短“窗口期”,HBV DNA檢測的臨床意義,調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBV DNA來決定。,HBV DNA檢測的臨床意義,HBV DNA檢測的臨床意義,HBsAg和HBeAg均陽性而HBV DNA陰性？,干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。 PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結(jié)合。 病毒DNA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBV DNA很少或缺乏。,目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達到50左右。 目前國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類： 干擾素：重組人-1b干擾素、- 2a、 -2b干擾素等。 核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。,乙肝的治療,主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等 對于HBV DNA105的患者應(yīng)進行抗病毒治療,乙肝的治療,謝 謝,