實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠電泳,山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,DNA重組：指不同來源的DNA片段共價連接，通過重新組合，構(gòu)成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新的重組體DNA。 DNA體外重組技術(shù)：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴(kuò)增、成為克隆，這一過程稱為DNA體外重組技術(shù)。DNA體外重組技術(shù)是基因工程的核心內(nèi)容。,基因克隆簡介,目的基因 載體 酶切，連接 重組基因 轉(zhuǎn)入 受體細(xì)胞 篩選陽性克隆,分,切、接,轉(zhuǎn),篩,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)流程圖,第一次,第二次,第三次,載體：可容忍外源性DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并能在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。 理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有的特性： 能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，并能攜帶DNA片段一同擴(kuò)增 具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn),即多克隆位點(diǎn)(MCS, multiple cloning sites)， 便于進(jìn)行克隆,分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制 易于導(dǎo)入受體細(xì)胞具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、 -互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選） 表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子，前導(dǎo)序列，增強(qiáng)子等調(diào)控元件 生物安全性好,載體種類： 質(zhì)粒 噬菌體載體 酵母人工染色體（YAC） 病毒載體,常用的克隆載體,質(zhì)粒 1.定義：質(zhì)粒是獨(dú)立存在于細(xì)菌染色體外的，能獨(dú)立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子?？少x予宿主細(xì)胞一定生物學(xué)性狀，如：抗生素抗性Ampr等。,2來源 存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。 3分類 質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒 嚴(yán)緊型質(zhì)粒(Stringent control) 嚴(yán)緊型質(zhì)粒只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時,它也不能復(fù)制,通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有 1 個或幾個質(zhì)粒,如 F 因子。 松弛型質(zhì)粒(Relaxed control) 松弛型質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制,在每個細(xì)胞中有許多拷貝,一般在 20 個以上,如 Col質(zhì)粒。 松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。,4.質(zhì)粒的構(gòu)型 （1）. 超螺旋DNA （supercoiled DNA, sc DNA）,超螺旋,（2）.開環(huán)DNA (open circle DNA, oc DNA),開環(huán)DNA,（3）.線形DNA（linear circle DNA，lc DNA),與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的兩種質(zhì)粒,1.PBR322(作為目的基因供體),4363bp,2.PUC18(作為載體）,實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒DNA提取,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。 2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作技術(shù)。,堿裂解法提取質(zhì)粒原理 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA的分子大小和結(jié)構(gòu)不同利用二者之間變性和復(fù)性的差異來實(shí)現(xiàn)分離的。,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳分離DNA原理,帶電顆粒在電場中泳動的速度,由于電場力的作用，使帶電顆粒在電場中向一定方向泳動；此顆粒在泳動過程中還受到一個相反方向的摩擦力(f)阻擋；當(dāng)這兩種力相等時，顆粒則以均勻速度()向前泳動,式中f為摩擦系數(shù)。根據(jù)Stoke公式，阻力大小取決于帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質(zhì)的黏度，即 式中 f阻力，牛頓； r粒子半徑，米； 介質(zhì)粘度，牛頓秒/米2；,從公式看出，帶電顆粒在電場中泳動的速度與電場強(qiáng)度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比,電泳遷移率 電泳遷移率（mobility）:在電位強(qiáng)度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。,d 為帶電顆粒泳動的距離(cm)； l 為支持物的有效長度(cm)； t為通電時間(秒)； V為加在支持物兩端的實(shí)際電壓(V),單位是cm2sec-1 V-1,實(shí)驗(yàn)步驟,加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm30S 重復(fù)一次，最后一次 將EP管放在吸水紙上扣干 除去上清，加入冰的100 l 溶液I，劇烈振蕩EP管 以下動作要輕柔 加入200l 溶液II，溫和顛倒數(shù)次，室溫放置3min 加入150l 冰溶液III，溫和顛倒2-3次，冰浴5min，12000rpm10min 轉(zhuǎn)移上清到新EP管（統(tǒng)一吸400 l ） 加入等體積氯仿，溫和混勻，12000rpm2min 上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管（統(tǒng)一吸300 l ） 加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置5min，12000rpm5min 棄上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm2min 去上清，管平放室溫靜置20-30min， 40 l TE 溶解DNA,瓊脂糖凝膠板的制備 （封板、制備1%凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）,倒緩沖液，加樣 （取質(zhì)粒DNA樣品液 10l + 2l上樣緩沖液，輕輕混勻，避免氣泡 ）,電泳（100V 0.5小時，5V/cm） 檢測 （紫外燈下檢測）,主要試劑及作用,1.solution： 蔗糖：增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒. (保護(hù)作用) EDTA ：絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子, 防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用） TrisHCl ：能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）,2.solutionII： SDS的作用裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用 NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用） 0.2mol/L NaOH 1%SDS 臨用前新鮮配制.,3.solutionIII： HAC溶液能中和溶液的堿性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性。 KAC會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的染色體DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。,4. 氯仿：進(jìn)一步沉淀去除蛋白質(zhì) 5. 無水乙醇：沉淀質(zhì)粒DNA 6. 70%乙醇：洗滌質(zhì)粒DNA 7. 上樣緩沖液（6x）：, 50%蔗糖：增加密度，以確保DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔內(nèi)。 溴酚藍(lán)：指示前沿。,便于觀察DNA片段的位置,質(zhì)粒三種構(gòu)型電泳時泳動速度大??？ 超螺旋DNA線形DNA開環(huán)DNA,在一定電場強(qiáng)度下，電泳泳動速度與分子量大小，分子形狀等有關(guān)，三種構(gòu)型分子量大小一致，而形狀不同，電泳泳動時空間位阻不同，超螺旋最小，其次是線形，最后是開環(huán)，故泳動速度超螺旋DNA線形DNA開環(huán)DNA,超螺旋 線形 開環(huán) 點(diǎn)樣孔,Elements,