DNA瓊脂糖凝膠電泳,實(shí) 驗(yàn) 二,學(xué)時(shí)：3,1、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理和方法。 2、學(xué)習(xí)核酸染色的方法。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?（一）電泳技術(shù)： 1、電泳定義：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。 根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，可分為濾紙，醋酸纖維薄膜，淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛，從分離小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒的分離鑒定都依賴(lài)于電泳技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)原理:,（1）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快； （2）顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快； （3） 溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快； （4）溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快；,2、影響電泳的主要因素：,（5）電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快； （6）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快； （7）電滲現(xiàn)象：電場(chǎng)中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)； （8）支持物篩孔大?。嚎讖叫?，電泳速度慢，反之則快。,瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡(jiǎn)便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。 瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來(lái)的，由半乳糖和3.6-脫水- 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠，電泳中具有分子篩效應(yīng)。,（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：,DNA分子在pH高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)（電荷效應(yīng)） 。 DNA分子泳動(dòng)速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)外，還與DNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的分子篩效應(yīng)）。 電泳時(shí)，用溴酚藍(lán)做前沿指示劑，指示DNA樣品在凝膠中的確切位置。 溴乙啶是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)堿基對(duì)之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。這次實(shí)驗(yàn)使用溴乙啶替代品（DNAgreen）,DNAgreen核酸染料,DNAgreen是一種花箐類(lèi)染料，具有安全、靈敏作為各種核酸電泳的染色劑。 DNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm還有一個(gè)吸收峰，與核酸結(jié)合后發(fā)射綠色熒光，因此在紫外凝膠透射儀上可以檢測(cè)出DNA樣品。 作為EB的一種替代品。,（1）核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 凝膠中，DNA片段遷移率與DNA分子大小成反比( 20kb) ，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。 （2）核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋洪]環(huán)DNA直線(xiàn)DNA開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA(當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA不能進(jìn)入膠中)。 （3）不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖濃度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線(xiàn)狀DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：DNA片段在5-500bp之間時(shí)，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行電泳分離。,（三）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素,（1）操作簡(jiǎn)單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分離DNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。（2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對(duì)樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。（3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光檢測(cè)及定量測(cè)定。（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一， DNA樣本的分離、純化、鑒定以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定常用瓊脂糖凝膠電泳。,（四）瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：,DNA Marker,熒光染料EB染色后，在紫外燈(305nm)下觀(guān)察到的電泳結(jié)果：,1、實(shí)驗(yàn)材料：提取的小麥苗中的DNA 2、儀器： (1)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (2)可調(diào)微量移液器 (3)水平電泳槽 （4）暗箱紫外透射儀等。 3、試劑： （1）電泳緩沖液：Tris-硼酸EDTA（50TBE）pH8.3。 （2）加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)（BPB），40%蔗糖，DNAgreen。 (4)瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%。,三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：,1、凝膠板的制備： （1）取瓊脂糖0.7 g，加1TBE緩沖溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的瓊脂糖膠液。 （2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8mm高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺(tái)面上。 （3）插入梳子，梳齒下端離板底0.51mm。 （4）當(dāng)瓊脂糖膠液溫度降到60的時(shí)候,將60凝膠不間斷倒入膠床，高34mm，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固。 （5）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面12mm，從一頭輕輕斜拉 梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。,四、實(shí)驗(yàn)步驟：,3、加樣： 將樣品DNA溶液與加樣緩沖液以5 ：1的體積比混合，用微量進(jìn)樣器加樣，每加完一個(gè)樣品，沖洗三次。加樣量1520 l （加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周?chē)哪z面以及穿透凝膠底部）。 4、電泳： 為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）開(kāi)始時(shí)用較高電壓(80V)，樣品一進(jìn)入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5V/cm 。當(dāng)染料前沿移至底邊1-2mm時(shí)，電泳畢。 5、染色、觀(guān)察、顯微照相與記錄： 關(guān)閉電源，取出膠床，浸入0.5g/mL的EB溶液中，30min后取出。在紫外檢測(cè)儀下觀(guān)察凝膠中的DNA（紅橙色熒光），并進(jìn)行顯微照相。最后要求繪制DNA電泳圖譜。,五、思考題：,影響電泳的主要因素?,* 熒光染料EB染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？ 1、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽(Ethidium Bromide)。 EB是一種扁平分子，它可以嵌入核酸相鄰的堿基之間，在紫外線(xiàn)激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。它與DNA的結(jié)合幾乎沒(méi)有堿基序列特異性。 溴化乙錠嵌入堿基分子中，導(dǎo)致DNA在復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配 。 所以溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程一定要帶上手套！,2、優(yōu)點(diǎn)： （1）染色比較簡(jiǎn)便、快捷，一般在1015min就可反應(yīng)。 （2）EB對(duì)核酸分子無(wú)破壞作用，這是其它染料所不能做 到的。 （3）EB靈敏度高，可檢測(cè)出10ng或更少的DNA含量。 （4）既可用于DNA也可用于RNA的檢測(cè)。 （5）EB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時(shí)用紫外 燈檢測(cè)電泳的進(jìn)程和效果。 （6）EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光比游離的EB強(qiáng)10倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的EB也可檢測(cè)出DNA的條帶。,3、缺點(diǎn)： 溴乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進(jìn)行處理。 （1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭； （2）室溫下放置1小時(shí)，不時(shí)的搖動(dòng)； （3）用新華一號(hào)濾紙過(guò)濾，棄濾液； （4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。 *溴乙啶在260分解，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行焚化后不會(huì)有危險(xiǎn)性。,終于下課了！,