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附件1 保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法 （KJ201901） 1　 范圍 本方法規(guī)定了保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的膠體金免疫層析快速篩查方法。 本方法適用于聲稱具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等功能的保健食品中西地那非和他達(dá)拉非成分的快速篩查。 2　 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的西地那非和他達(dá)拉非等物質(zhì)經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測(cè)卡中檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過檢測(cè)線與控制線（C線）顏色深淺比較，對(duì)樣品中西地那非和他達(dá)拉非成分進(jìn)行定性判定。 3　 試劑材料 3.1　 試劑 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1.1　 甲醇：色譜純。 3.1.2　 三羥甲基氨基甲烷，Tris堿。 3.1.3　 濃鹽酸。 3.1.4　 吐溫-20。 3.1.5　 鹽酸溶液：量取濃鹽酸（3.1.3）16.7 mL，用水溶解并稀釋至100 mL。 3.1.6　 緩沖液：稱取12.1 g Tris堿（3.1.2），加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液（3.1.5）調(diào)節(jié)pH至8.0，加入5.0 g吐溫-20（3.1.4）攪拌均勻，定容至1000 mL。 3.2　 參考物質(zhì) 參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見表1，純度均≥99%。 表1 參考物質(zhì)信息表 序號(hào) 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子量 1 西地那非 Sildenafil 139755-83-2 C22H30N6O4S 474.58 2 他達(dá)拉非 Tadalafil 171596-29-5 C22H19N3O4 389.40 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 3.3.1　 西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：精密稱取適量西地那非參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃避光保存，有效期1年。 3.3.2　 西地那非標(biāo)準(zhǔn)工作液（10?μg/mL）：精密移取適量西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）（3.3.1）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為10?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20℃避光保存，有效期3個(gè)月。 3.3.3　 他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.5 mg/mL）：精密稱取適量他達(dá)拉非參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.5?mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃避光保存，有效期1年。 3.3.4　 他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)工作液（10?μg/mL）：精密移取適量他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.5mg/mL）（3.3.3）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20℃避光保存，有效期3個(gè)月。 3.4　 材料 西地那非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 他達(dá)拉非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 4　 設(shè)備與儀器 4.1　 設(shè)備 4.1.1　 天平：感量為0.1 mg和0.01 g。 4.1.2　 渦旋混合器。 4.1.3　 移液器：20-200 μL，100-1000 μL，5 mL。 4.1.4　 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)4000 r/min以上。 4.2　 儀器 4.2.1　 讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測(cè)儀器（可選）。 4.2.2　 環(huán)境條件：溫度10-40℃，相對(duì)濕度≤80%。 5　 分析步驟 5.1　 試樣制備 液體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。 5.2　 試樣提取和凈化 5.2.1　 液體基質(zhì) 量取0.5 mL±0.02 mL試樣于15 mL離心管中，加入4 mL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30 s，作為待測(cè)液。 5.2.2　 固體基質(zhì) 5.2.2.1　 檢測(cè)西地那非 準(zhǔn)確稱取試樣0.5 g±0.01 g于15 mL離心管中，加1 mL甲醇（3.1.1），渦旋30 s，4000 rpm離心2 min或靜置2 min。取250 μL上清液于2 mL離心管中，加入750 μL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30s，作為待測(cè)液。 5.2.2.2　 檢測(cè)他達(dá)拉非 準(zhǔn)確稱取試樣0.5 g±0.01 g于15 mL離心管中，加1 mL甲醇（3.1.1），渦旋30 s，4000 rpm離心2 min或靜置2 min。取200 μL上清液于15 mL離心管中，加入3 mL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30 s，作為待測(cè)液。 注：試樣提取和凈化（5.2）過程可按照試劑盒說明書操作，不做限定。 5.3　 測(cè)定步驟 5.3.1　 試紙條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟 吸取200 μL樣品待測(cè)液于金標(biāo)微孔中，抽吸5~10次使混合均勻，室溫溫育5 min；溫育結(jié)束后，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，室溫溫育5 min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，進(jìn)行結(jié)果判定。 注：測(cè)定步驟建議按照試劑盒說明書。 5.3.2　 檢測(cè)卡與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟 吸取200 μL上述待測(cè)液于金標(biāo)微孔中，上下抽吸5~10次使混合均勻。室溫溫育5 min，將反應(yīng)液全部加入到檢測(cè)卡的加樣孔中，將金標(biāo)微孔中全部溶液滴加到檢測(cè)卡上的加樣孔中，溫育5 min，進(jìn)行結(jié)果判定。 注：測(cè)定步驟建議按照試劑盒說明書。 5.4　 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。 5.4.1　 空白試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取固體空白試樣0.5 g±0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL±0.02 mL于15 mL離心管中，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 5.4.2　 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取固體空白試樣0.5 g±0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL±0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使西地那非參考物質(zhì)濃度為1.0 μg/g或1.0 μg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 準(zhǔn)確稱取固體空白試樣0.5 g±0.01 g或液體空白試樣0.5 mL±0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.4），使他達(dá)拉非參考物質(zhì)濃度為1.0 μg/g或1.0 μg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 6　 結(jié)果判定 通過對(duì)比控制線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視判定示意圖見圖1。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。 6.1　 無效 控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條無效。 6.2　 陰性結(jié)果 控制線（C線）顯色，檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或檢測(cè)線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，均表示樣品中不含待測(cè)組分或含量低于方法檢測(cè)限，判為陰性。 6.3　 陽性結(jié)果 控制線（C線）顯色，檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色明顯淺或檢測(cè)線（T線）不顯色，均表示樣品中待測(cè)組分含量高于方法檢測(cè)限，判為陽性。 6.4　 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽性。 圖1 目視判定示意圖 7　 結(jié)論 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 8　 性能指標(biāo) 8.1　 檢出限 固體樣品1.0 μg/g，液體樣品1.0 μg/mL。 8.2　 靈敏度 靈敏度≥95%。 8.3　 特異性 特異性≥90%。 8.4　 假陰性率 假陰性率≤5%。 8.5　 假陽性率 假陽性率≤10%。 注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。 9　 其他 本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進(jìn)行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標(biāo)。 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。但方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS201710《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)》、藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009030《補(bǔ)腎壯陽類中成藥中PDE-5型抑制劑的快速檢測(cè)方法》。 本方法使用西地那非試劑盒可能與那莫西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、偽伐地那非、伐地那非、硫代艾地那非存在交叉反應(yīng)；他達(dá)拉非試劑盒可能與氨基他達(dá)拉非、去甲基他達(dá)拉非存在交叉反應(yīng)；當(dāng)結(jié)果判定為陽性應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 - 8 - 附錄A 定性方法性能指標(biāo)計(jì)算表 表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽性 陰性 陽性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異（c2） c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21）， 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法負(fù)責(zé)起草單位：廣東省食品檢驗(yàn)所。 驗(yàn)證單位：江蘇省南通市食品藥品監(jiān)督檢測(cè)中心、南京工業(yè)大學(xué)。 主要起草人：劉海虹、申超群、鄧皇翼、雷毅。