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1、 第43講　生物化學與分子生物學技術實踐 [考綱要求]　1.蛋白質的提取和分離。2.PCR技術的基本操作和應用。3.從生物材料中提取某些特定的成分。 考點一　生物技術實踐——蛋白質的分離與純化 1．純化原理 蛋白質之間以及蛋白質與其他物質之間在分子大小、溶解度、所帶電荷的多少、吸附性質等方面存在差異。 2．純化方法 (1)透析法 ①原理：蛋白質水溶液具有親水膠體溶液性質，不能透過半透膜。 ②目的：去除小分子化合物雜質，如無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸等。 ③常用的半透膜：腸衣、玻璃紙。 ④步驟：將待純化的蛋白質溶液裝入透析袋內，再把透析袋放入透析液中即可。 (2)離

2、心法 ①原理：在離心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，從而被分離。 ②目的：使分子大小、密度不同的不同種類的蛋白質彼此分離。 (3)電泳 ①概念：帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。 ②原理：不同的物質所帶電荷不同，顆粒的大小、形狀不同，因此，在電場中的泳動速度不同。 ③影響泳動的因素：帶電顆粒的性質，即顆粒的大小、形狀和所帶凈電荷的多少；此外還有電場強度、溶液的pH等因素。 ④泳動特點：帶電顆粒直徑越小，越接近于球形，所帶凈電荷越多，則在電場中的泳動速度越快；反之，則越慢。 ⑤支持物：濾紙、醋酸纖維薄膜、大分子凝膠等。 易錯警示　(1)注意

3、：透析時間為12 h。透析袋是用硝酸纖維素制成，小分子可自由進出，而大分子保留在袋內。 (2)關鍵步驟及其技術要求：點樣是本實驗的關鍵步驟。點樣前，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散；但不易太干，否則樣品不易進入膜內，造成點樣起始參差不齊，影響分離效果。 1．仔細觀察下圖，所帶負電荷少的球蛋白是 (　　) A．α1-球蛋白 B．α2-球蛋白 C．β-球蛋白 D．γ-球蛋白 答案　D 解析　對于幾種球蛋白來說直徑相差不大，引起泳動速度的差異主要來自于所帶電荷多少，由圖可知球蛋白由右向左泳動，因右側為負極，且γ-球蛋白距

4、點樣處最近，所以γ-球蛋白所帶負電荷最少。 1．透析 (1)過程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12h。 (2)圖示： 2．血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 (1)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳流程 (2)結果及其分析 ①結果 ②結果分析 從電泳圖譜示意圖中可以看出：a.血清蛋白主要包括五種蛋白質，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：γ-球蛋白>α1-球蛋白>α2-球蛋白>β-球蛋白； 由五種蛋白質所處的位置可判斷出它們均帶有負電荷，且四種球蛋白的電量大小依次為：α1-

5、球蛋白>α2-球蛋白>β-球蛋白>γ-球蛋白。 考點二　從生物材料中提取某些特定成分 1．植物芳香油的基本知識 (1)成分：組成較復雜，主要包括萜類化合物及其衍生物。 (2)特點：具有很強的揮發(fā)性，易溶于有機溶劑。 (3)應用：玫瑰精油是制作高級香水的主要成分，能使人產生愉悅感；橘皮精油的主要成分是檸檬烯，具誘人的橘香味，是食品、化妝品和香水配料的優(yōu)質原料。 2．橘皮精油的提取流程與關鍵 石灰水浸泡→漂洗→壓榨→過濾→靜置→再次過濾→橘皮精油 (1)橘皮的處理：干燥后一定要用石灰水浸透，時間至少10 h以上。 (2)壓榨液的處理：可以先用普通布袋過濾除去固體物和殘渣，然后

6、離心進一步除去質量較小的殘留固體物，再用分液漏斗或吸管將上層的橘皮精油分離出來。 易錯警示　(1)植物芳香油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、壓榨法、萃取法。水蒸氣蒸餾是植物芳香油提取的常用方法，但會導致原料焦糊或有效成分水解等，若植物有效成分易水解，則不宜采用此法。玫瑰精油、橘皮精油、胡蘿卜素的提取分別采用水蒸氣蒸餾法、壓榨法、萃取法。 (2)水蒸氣蒸餾可用明火加熱，萃取過程應該避免明火加熱，采取水浴加熱，這是因為有機溶劑都是易燃物，直接用明火加熱容易引起燃燒、爆炸。 (3)用于萃取的有機溶劑必須事先精制，除去雜質，否則會影響芳香油的質量。 (4)在用水蒸氣蒸餾法制取玫瑰精油時，玫瑰乳濁

7、液提純過程中油水混合物中要加入氯化鈉的目的是增大鹽水的密度，有利于玫瑰精油與水的分層。加入無水Na2SO4的目的是吸收精油中殘留的水分。 (5)橘皮精油的提取過程中，橘皮洗凈晾干后，要浸泡在pH大于12、質量分數(shù)為7%～8%的石灰水中16～24 h，其目的是防止橘皮壓榨時滑脫，提高出油率。 2．請回答下列與實驗室提取芳香油有關的問題： (1)植物芳香油的提取可采用的方法有壓榨法、 和 。 (2)芳香油溶解性的特點是難溶于 ，易溶于 ，因此可用 作為提取劑來提取芳香油。 (3)橘子果實含有芳香油，通?？捎?

8、 作為材料提取芳香油，而且提取時往往選用新鮮的材料，理由是 。 (4)對材料壓榨后可得到糊狀液體，為除去其中的固體物獲得乳狀液可采用的方法是 。 (5)得到的乳狀液加入氯化鈉并放置一段時間后，芳香油將分布于液體的 層，原因是 。 加入氯

9、化鈉的作用是 。 (6)從乳狀液中分離得到的芳香油中要加入無水硫酸鈉，其作用是 。 答案　(1)蒸餾法　萃取法　(2)水　有機溶劑　有機溶劑(3)橘子皮　芳香油含量較高　(4)過濾　(5)上　油層的密度比水層小　增加水層密度，使油和水分層　(6)吸收芳香油中殘留的水分 解析　植物芳香油的提取可采用的方法有壓榨法、蒸餾法和萃取法。一般采用新鮮的橘子皮來提取芳香油，因為新鮮的橘子皮

10、芳香油含量較高。除去液體中的固體常用的方法是過濾。芳香油密度比水小，且不溶于水，會浮在液體的表面。加入氯化鈉會增加水層密度，使油和水分層。無水硫酸鈉可以吸收芳香油中殘留的水分。 植物芳香油提取方法的比較 提取方法 水蒸氣蒸餾法 壓榨法 萃取法 實驗原理 利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來 通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油 使芳香油溶解在有機溶劑中，蒸發(fā)溶劑獲得芳香油 方法步驟 ① 水蒸氣蒸餾 ②分離油層 ③除水過濾 ①石灰水浸泡、漂洗 ②壓榨、過濾、靜置 ③再次過濾 ①粉碎、干燥 ②萃取、過濾 ③濃縮 適用范圍 適用于提取玫瑰油、薄荷油等

11、揮發(fā)性強的芳香油 適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提取 適用范圍廣，要求原料的顆粒要盡可能細小，能充分浸泡在有機溶劑中 優(yōu)點 簡單易行，便于分離 生產成本低，易保持原料原有的結構和功能 出油率高，易分離 局限性 水中蒸餾會導致原料焦糊和有效成分水解等問題 分離較為困難，出油率相對較低 使用的有機溶劑處理不當會影響芳香油的質量 考點三　PCR技術 1．PCR原理 DNA熱變性原理，即： 2．條件：模板、原料、酶、ATP。 3．場所：體外PCR擴增儀。 4．方向：DNA復制的具體過程涉及DNA雙鏈的方向。DNA的兩條鏈是反向平行的，為了明確地表示DNA的方

12、向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，兩個磷酸基團的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 5．過程 (1)變性：當溫度上升到94 ℃以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈，如下圖： (2)退火：溫度下降到40～60 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合，如下圖： (3)延伸：溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配

13、對原則合成新的DNA鏈，如下圖： 易錯警示　(1)引物是指能夠與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的一小段DNA或RNA。 (2)PCR技術只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。 3．多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。請回答下列有關PCR技術的基本原理及應用問題： (1)DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將 的末端稱為5′端，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的 開始延伸DNA鏈。 (2)PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈

14、的問題，但又導致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀80年代，科學家從一種Taq細菌中分離到 ，它的發(fā)現(xiàn)和應用解決了上述問題。要將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來，所用的培養(yǎng)基叫 。 (3)PCR的每次循環(huán)可以分為 三步。假設在PCR反應中，只有一個DNA片段作為模板，請計算在5次循環(huán)后，反應物中大約有 個這樣的DNA片段。 (4)請用簡圖表示出一個DNA片段PCR反應中第二輪的產物。 (5)簡述PCR技術的主要應用。

15、 。 答案　(1)磷酸基團　3′端　(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶　選擇培養(yǎng)基　(3)變性、退火和延伸　32 (4)如圖所示 (5)遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定(要求3項以上) 解析　(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已經(jīng)存在的核酸的3′-羥基上，與DNA母鏈結合的引物就提供這個羥基。(2)因PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，所以用于催化DNA復制過程的

16、DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇培養(yǎng)基可將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來。(3)DNA復制時兩條鏈均作為模板，進行半保留復制，所以復制5次后得到的子代DNA分子數(shù)為25＝32個。(4)新合成的DNA鏈帶有引物，而最初的模板DNA的兩條鏈不帶有引物。(5)PCR技術可以對DNA分子進行擴增，所以可用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等方面。 PCR技術和DNA復制的比較 DNA復制 PCR技術 場所 細胞核內 生物體外 原理 堿基互補配對 堿基互補配對 酶 DNA聚合酶、解旋酶 耐熱的DNA聚合酶(Taq酶) 條件 模

17、板、ATP、引物鏈(RNA)、常溫 模板、ATP、引物鏈(DNA及RNA片段)、溫度變化(94 ℃→40～60 ℃→70～75 ℃) 原料 四種脫氧核苷酸 四種脫氧核苷酸 特點 形成的是整個DNA分子，一個細胞周期只復制一次 短時間內形成大量目的基因DNA片段，呈指數(shù)增長——2n (2010·課標全國卷，37)下列是與芳香油提取相關的問題，請回答： (1)玫瑰精油適合用水蒸氣蒸餾法提取，其理由是玫瑰精油具有 的性質。蒸餾時收集的蒸餾液 (是、不是)純的玫瑰精油，

18、 。 (2)當蒸餾瓶中的水和原料量一定時，蒸餾過程中，影響精油提取量的主要因素有蒸餾時間和 。當原料量等其他條件一定時，提取量隨蒸餾時間的變化趨勢是 。 (3)如果蒸餾過程中不進行冷卻，則精油提取量會 ，原因是

19、 。 (4)密封不嚴的瓶裝玫瑰精油保存時最好存放在溫度 的地方，目的是 。 (5)某植物花中精油的相對含量隨花的不同生長發(fā)育時期的變化趨勢如圖所示。提取精油時采摘花的最合適時間為 天左右。 (6)從薄荷葉中提取薄荷油時 (能、不能)采用從玫 瑰花中提取玫瑰精油的方法，理由是

20、 。 答案　(1)易揮發(fā)、難溶于水、化學性質穩(wěn)定　不是　玫瑰精油與水蒸氣一起蒸餾出來，所得到的是油水混合物 (2)蒸餾溫度　在一定的時間內提取量隨蒸餾時間的延長而增加，一定時間后提取量不再增加 (3)下降　部分精油會隨水蒸氣揮發(fā)而流失 (4)較低　減少揮發(fā)　(5)a (6)能　薄荷油與玫瑰精油的化學性質相似 解析　由于玫瑰精油易揮發(fā)，難溶于水，化學性質穩(wěn)定，因此可以用水蒸氣蒸餾法提取，冷卻后必然含有水；蒸餾的提取效果與蒸餾的溫度與蒸餾的時間有關，隨著蒸餾時間的延長，原料中含有的精油減少，提取的量也會減少直至再也提不出精油。蒸餾過程中，如果不

21、冷卻，提取后的混合液溫度較高，由于精油易揮發(fā)，其中的含量會降低；保存時，環(huán)境溫度應較低為好，防止精油揮發(fā)；第(5)小題為信息題，主要考查學生的讀圖、識圖及圖文轉化能力，根據(jù)圖像可知，玫瑰精油在蓓蕾期、開放期之間花的含量較高，應在此時采收；由于薄荷精油與玫瑰精油的化學性質相似，可以采用相同的提取方法。 1．有關透析的敘述中，錯誤的是 (　　) A．用于透析的薄膜要具有選擇透過性 B．透析膜一般是由硝酸纖維素制成的 C．透析能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內 D．透析可用于更換樣品的緩沖液 答案　A 解析　透析袋一般是用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成的，它沒

22、有生物活性，故不具有選擇透過性(活的生物膜才具有選擇透過性)。透析袋能使小分子物質自由進出，而將大分子保留在袋內。透析可以去除樣品中相對分子質量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。 2．關于蛋白質提取的敘述中，不正確的是 (　　) A．分離與純化蛋白質之前首先要用適當?shù)姆椒ㄊ沟鞍踪|釋放出來 B．抽提時要依據(jù)蛋白質的不同特性選擇不同的溶劑 C．蛋白質的粗提取物離心可除去一些小分子雜質 D．蛋白質的粗制品可能是多種蛋白質的混合物 答案　C 解析　對抽提得到的粗提取物離心可除去固體雜質。 3．在PCR實驗操作中，下列說法不正確的是 (　　) A．在微量離

23、心管中添加各種試劑時，只需一個槍頭 B．離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止液體外溢 C．用手輕彈離心管壁的目的是使反應液充分混合 D．離心的目的是使反應液集中在離心管底部，使反應效果更明顯 答案　A 解析　在微量離心管中添加各種試劑時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換，確保實驗的準確性；離心10 s的目的是使反應液集中在離心管底部，使反應效果更明顯。 4．某同學做PCR反應的實驗時，他最關鍵的是需要嚴格控制 (　　) A．氧氣的濃度 B．酸堿度 C．溫度 D．大氣的濕度 答案　C 解析　高溫變性、低溫退火、中溫延伸三大步驟構成了PCR過程的

24、循環(huán)，所以PCR反應需要嚴格的控制溫度。 5．從下列植物中提取植物芳香油時，可采用水蒸氣蒸餾法的一組是 (　　) ①玫瑰花?、陂倨ぁ、圮岳蚧ā、芄鸹? A．①② B．③④ C．①③ D．②④ 答案　C 解析　用水蒸氣蒸餾法提取植物芳香油時，芳香油要具有易揮發(fā)的特點，且在蒸氣中有效成分不能受到破壞。從橘皮中提取橘皮精油時，若采用水蒸氣蒸餾法，則會發(fā)生部分水解，使用水中蒸餾又會產生原料焦糊的問題，因此，一般采用壓榨法。桂花油易溶于有機溶劑，因此用萃取法提取較好。玫瑰精油和茉莉油都具有揮發(fā)性，且在蒸氣中不被破壞，故采用水蒸氣蒸餾法提取。 6．玫瑰精油被稱為“液體黃金”

25、，其提取方法可用 (　　) A．只能用水蒸氣蒸餾法 B．可用蒸餾法和壓榨法 C．可用蒸餾法和萃取法 D．可用壓榨法和萃取法 答案　C 解析　根據(jù)玫瑰精油化學性質穩(wěn)定、難溶于水、易溶于有機溶劑的特點，鮮玫瑰花可采用蒸餾法，而干玫瑰花可采用萃取法，但一般不采用壓榨法。 7．血清蛋白電泳時通常用pH為8.6的緩沖液，此時各種蛋白質帶有的電荷為(　　) A．清蛋白帶正電荷，其他球蛋白帶負電荷 B．清蛋白帶負電荷，其他球蛋白帶正電荷 C．清蛋白與其他球蛋白均帶負電荷 D．清蛋白與其他球蛋白均帶正電荷 答案　C 解析　pH為8.6的緩沖液既能維持血清蛋白的生

26、物活性，又能使血清中各種蛋白質帶同一種電荷—負電荷，這樣在負極端點樣，它們都向正極移動，根據(jù)移動速度不同達到分離目的。 8．使用水蒸氣蒸餾法提取玫瑰精油，是因為 (　　) A．其化學性質穩(wěn)定，難溶于水，易溶于有機溶劑，能隨水蒸氣一同蒸餾 B．其化學性質穩(wěn)定，難溶于水，難溶于有機溶劑，能隨水蒸氣一同蒸餾 C．其化學性質不穩(wěn)定，難溶于水，易溶于有機溶劑，不能隨水蒸氣一同蒸餾 D．其化學性質不穩(wěn)定，難溶于水，難溶于有機溶劑，不能隨水蒸氣一同蒸餾 答案　A 9．閱讀以下材料，回答相關問題： 從玫瑰花中提取出的玫瑰精油被稱為“液體黃金”，是世界香料工業(yè)不可取代的原料，多用于

27、制造高級香水、化妝品等。提取出的玫瑰精油不含有任何添加劑或化學原料，是純天然的護膚品，具有極好的抗衰老和止癢作用，能夠促進細胞的再生、防止肌膚老化、撫平肌膚細紋，還具有使人放松、愉悅心情的功效。玫瑰精油的化學性質穩(wěn)定，難溶于水，易溶于有機溶劑，揮發(fā)性較強。 (1)根據(jù)材料中介紹的玫瑰精油的性質，要提取玫瑰精油可以用水中蒸餾和 法提取，但一般采用水中蒸餾的方法，其原因是該法具有 的優(yōu)點。 (2)某同學在實驗中設計了如圖所示的裝置提取玫

28、瑰精油，指出該裝置中的兩個錯誤，并予以改正。 ①錯誤1： ； 改正： 。 ②錯誤2： ； 改正：

29、 。 (3)對用上述裝置接收到的乳濁液進行如下處理： 玫瑰油與水的混合物分層油層無水玫瑰精油較純凈的玫瑰精油。 試劑A是 ，試劑C是 ，裝置B是 ，試劑C的作用是 。 答案　(1)萃取　設備簡單、成本低、易操作 (2)①溫度計位置過低　溫度計的液泡與蒸餾燒瓶的支管口下沿保持水平?、诶淠苓M水口、出水口接錯　冷凝管進水口在下，出水口在上，

30、與蒸氣流向相反　(3)NaCl溶液　無水Na2SO4　分液漏斗　吸去油層中少量的水分 解析　(1)應根據(jù)原料特點來選擇提取方法。玫瑰精油揮發(fā)性強，化學性質穩(wěn)定，可以用蒸餾法提取，另外玫瑰精油不溶于水，易溶于有機溶劑，故對于干玫瑰花還可以用有機溶劑萃取的方法。(2)蒸餾裝置中，溫度計測的是蒸氣溫度，應使其液泡與蒸餾燒瓶支管口下沿相平；冷凝管應進水口在下，出水口在上，與蒸氣流向相反。(3)為促進蒸餾得到的乳濁液分層，可加入NaCl溶液，而后用分液漏斗將其分開，得到的油層中還含有少量水分，可以用無水Na2SO4吸收，然后過濾即可。 10．近十年來，PCR技術(多聚酶鏈式反應)成為分子生物學實驗室

31、里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復制，在試管中進行DNA的人工復制(如圖)，在很短的時間內，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需要的遺傳物質不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈打開，這一步是打開 鍵，稱為 ，細胞中是在 的作用下使此鍵斷裂的。 (2)當溫度降低時，引物與模板 端結合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成2個DNA分子，此過程中的原料是 ，遵循的原則是 。 (3)PCR技術的必要條件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少還需要三個條件，即：液體環(huán)境、適宜的 和 。 (4)PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 、 三個步驟。 答案　(1)氫　解旋　解旋酶 (2)3′　四種脫氧核苷酸　堿基互補配對原則 (3)溫度　酸堿度 (4)變性　退火　延伸