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附件5 水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測 膠體金免疫層析法 （KJ201905） 1 范圍 本方法規(guī)定了水產(chǎn)品中氯霉素的膠體金免疫層析快速檢測方法。 本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速測定。 2 原理 本方法的測定以競爭抑制免疫層析原理為基礎。樣品中的氯霉素經(jīng)有機試劑提取，固相萃取小柱凈化，濃縮復溶后，氯霉素與膠體金標記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和微孔膜檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線顏色深淺比較，對樣品中氯霉素含量進行定性判定。 3 試劑和材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 3.1 試劑 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4乙腈 3.1.5磷酸二氫鈉，NaH2PO4·2H2O。 3.1.6磷酸氫二鈉，Na2HPO4·12H2O。 3.1.7 氯化鈉 3.1.8 復溶液：稱取0.12 g磷酸二氫鈉 (3.1.5)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液A；稱取磷酸氫二鈉7.16 g (3.1.6)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液B。取溶液A 2.8 mL、溶液B 7.2 mL、氯化鈉(3.1.7)0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液，即為復溶液。。 3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按體積比1：9混勻。 3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按體積比6：4混勻。 3.2 標準物質(zhì) 氯霉素標準物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分之式、相對分子質(zhì)量見表1，純度≥98.6%。 表1 氯霉素參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號 分子式 相對分子量 氯霉素 Chloramphenicol 56-75-7 C11H12Cl2N2O5 323.13 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3標準溶液配制 3.3.1 氯霉素標準儲備液（1 mg/mL）：精密稱取氯霉素標準物質(zhì)（3.2）10 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的氯霉素標準儲備液。4℃避光保存，有效期6個月。 3.3.2 氯霉素標準中間液A（10 μg/mL）：精密量取氯霉素標準儲備液（1 mg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀釋至刻度，搖勻，制成 10 μg/mL的氯霉素標準中間液A。4℃避光保存，有效期3個月。 3.3.3 氯霉素標準工作液（0.01 μg/mL）：精密移取氯霉素標準中間液A（10 μg/mL）（3.3.2）0.01 mL分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.01 μg/mL的氯霉素標準工作液。臨用新配。 3.4材料 3.4.1固相萃取小柱：Cleanert Silica，200 mg/6mL。LOT：0170198。 3.4.2免疫膠體金試劑盒（在2～30℃、干燥陰涼條件下保存，在產(chǎn)品有效期內(nèi)使用）。 3.4.2.1 金標微孔。 3.4.2.2 試紙條或檢測卡。 4 儀器和設備 4.1 移液器：200 μL、1 mL和5 mL。 4.2 渦旋混合器。 4.3 離心機：轉(zhuǎn)速≥4000 r/min。 4.4 電子天平：感量分別為 0.01 mg和 0.01 g。 4.5 樣品濃縮儀：如有需要。 4.6 環(huán)境條件： 溫度：15～25℃，相對濕度：≤60%。 5分析步驟 5.1試樣制備 取具有代表性樣品約500 g，充分粉碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密封，標記，于常溫保存。 5.2試樣提取和凈化 準確稱取試樣6 g（精確至0.01 g）置于50 mL具塞離心管中，依次加入1 mL水和8 mL乙酸乙酯（3.1.3），渦旋提取5 min，以4000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層于50 mL具塞離心管中，加入正己烷25 mL，氯化鈉1 g渦旋混勻，4000 r/min 離心1 min，上清液待凈化。5 mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將待凈化溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5 mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脫，收集洗脫液，洗脫液于40℃氮氣吹干，精密加入600 μL復溶液（3.1.8），渦旋混合1 min，作為待測液。 5.3 測定步驟 5.3.1 檢測卡與金標微孔測定步驟 吸取150 μL樣品待測液于反應微孔（3.4.2.1）中，抽吸 5～10次使混合均勻，室溫溫育3 min；溫育結(jié)束后，將金標微孔中溶液滴加到檢測卡（3.4.2.2）上的加樣孔中，室溫溫育5～8 min，對結(jié)果進行判定。 5.3.2 試紙條與金標微孔測定步驟 吸取150 μL樣品待測液于反應微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均勻，室溫溫育3 min；溫育結(jié)束后，將檢測試紙條（3.4.2.2）吸水海綿端垂直向下插入反應微孔中，室溫溫育3 min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，并于5 min內(nèi)進行結(jié)果判定。 5.3.3 檢測卡測定步驟 吸取150 μL樣品待測液滴加到檢測卡（3.4.2.2）上的加樣孔中，室溫溫育5～8 min，對結(jié)果進行判定。 5.4質(zhì)控試驗 每批樣品應同時進行空白試驗和加標質(zhì)控試驗。 5.4.1 空白試驗 稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 5.4.2 加標質(zhì)控試驗 準確稱取空白樣品6 g或適量（精確至0.01 g）置于15 mL具塞離心管中，加入180 μL氯霉素標準工作液（0.01 μg/mL）（3.3.3），使氯霉素濃度為0.3 μg/kg，一式2份，按照 5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 6 結(jié)果判定要求 通過對比控制線和檢測線的顏色深淺進行結(jié)果判定。由于長時間放置會引起檢測線顏色的變化，需在規(guī)定時間內(nèi)進行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀依據(jù)如圖1所示。 6.1 無效 控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。 6.2 陽性結(jié)果 檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測限，判定為陽性。 6.3 陰性結(jié)果 檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，表明樣品中氯霉素含量低于方法檢測限，判定為陰性。 6.4質(zhì)量控制要求 空白試驗測定結(jié)果應為陰性，加標質(zhì)控試驗測定結(jié)果應為陽性。 7 結(jié)論 如被測樣品中氯霉素檢測結(jié)果為陽性時，應采用確證方法進行確證檢測。 8 性能指標 8.1 檢測限 氯霉素為0.1 μg/kg。 8.2 靈敏度 靈敏度應≥98%。 8.3 特異性 特異性應≥90%。 8.4 假陰性率 假陰性率應≤1%。 8.5 假陽性率 假陽性率應≤10%。 注：性能指標計算方法見附錄A 9其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規(guī)定的各項性能指標。 本方法參比標準為GB/T 22338-2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定 (包括所有修改單)。 附錄 A 定性方法性能計算表 樣品情況a 檢驗結(jié)果b 總數(shù) 陽性 陰性 陽性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異(χ2) χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1 靈敏度（p+） p+=N11/N1. 特異性（p-） p-=N22/N2. 假陰性率(pf-) pf-=N12/N1.=1-靈敏度 假陽性率(pf+) pf+=N21/N2.=1-特異性 相對準確度 （N11+N22）/(N1.+N2.) 注：N:任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 a由基準方法檢驗得到的結(jié)果； b由本方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認后的結(jié)果。 本方法負責起草單位：山西省食品藥品檢驗所。 驗證單位：陜西省食品藥品檢驗所、廣東省藥品檢驗所、四川省食品藥品檢驗檢測院。 主要起草人：李倩、閻安婷、陳煜、楊國偉。 5