實(shí)驗(yàn)10 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA,一、實(shí)驗(yàn)原理,DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA 分子在高于等電點(diǎn)的pH 溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙漣DNA 幾乎具有等量 凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA 分子本身的大小 和構(gòu)型。,一、實(shí)驗(yàn)原理,具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。,二、實(shí)驗(yàn)儀器,1 恒溫培養(yǎng)箱 2 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 3 臺(tái)式離心機(jī) 4 高壓滅菌鍋 5 紫外線透射儀 6 凝膠成像系統(tǒng),三、實(shí)驗(yàn)試劑,Loading dye (0.25%溴酚蘭+40%蔗糖水溶液) 10ml需0.025g溴酚蘭和4g蔗糖 B：需1g溴化乙錠 TBE：TBE貯液2L：108g Tris-base、 55g硼酸、40ml 0.5M的EDTA(pH8.0) 需7.4g disodium2H2O 瓊脂糖：30g,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1 用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺(tái)上； 2 調(diào)整好梳子的高度； 3 稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完 全溶解，冷卻至45-50C時(shí)倒入制膠板中； 4 凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；,四、實(shí)驗(yàn)步驟,5 將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中； DNA 5l + ddH2O 3l + 溴酚藍(lán)2l 共10l于0.5ml tube中混合后點(diǎn)樣； 6 將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動(dòng)； 7 電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 g/ml的溴化乙錠（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。,五、主要事項(xiàng),1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素： a DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋線性DNA） b 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Kr 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb,五、主要事項(xiàng),c DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。 d 所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm,五、主要事項(xiàng),e 堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 f 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中) g 電泳緩沖液（0.5TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無(wú)離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。,五、主要事項(xiàng),2 溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。 3 電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。,六、思考題,1、DNA在電場(chǎng)中的遷移率取決于哪些因素？ 2、瓊脂糖凝膠有哪些注意事項(xiàng)？,