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附件8 液體乳中三聚氰胺的快速檢測(cè) 拉曼光譜法 （KJ201908） 1　 范圍 本方法規(guī)定了液體乳制品中三聚氰胺快速測(cè)定方法。 本方法適用于生鮮乳、滅菌乳、巴氏殺菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳等液態(tài)乳制品中三聚氰胺含量的快速測(cè)定。 2　 原理 樣品經(jīng)沉淀、溶劑提取，加表面增強(qiáng)拉曼試劑對(duì)信號(hào)增強(qiáng)，進(jìn)行拉曼光譜掃描。以704±10cm-1處的拉曼特征峰作為三聚氰胺定量基準(zhǔn)峰，以925±10cm-1或類似基質(zhì)中穩(wěn)定存在的拉曼峰為參比峰，根據(jù)三聚氰胺峰與參比峰的相對(duì)強(qiáng)度對(duì)三聚氰胺的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置儀器內(nèi)進(jìn)行判別。 3　 試劑和材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1　 試劑 3.1.1　 三氯乙酸。 3.1.2　 三氯乙酸溶液（5%）：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸（3.1.1）50 g于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。 3.1.3　 表面增強(qiáng)試劑：金或銀納米粒子溶膠，或相當(dāng)者。 注：表面增強(qiáng)試劑的參考配制方法： 納米金溶膠：取100mL0.01%氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）水溶液加熱至沸，劇烈攪拌下準(zhǔn)確加入1.0mL 1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，金黃色的氯金酸水溶液在2min內(nèi)變?yōu)榧t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后用蒸餾水補(bǔ)加到100mL。增強(qiáng)試劑配制用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。 納米銀溶膠：取200mL1.0mM硝酸銀（AgNO3）水溶液加熱沸騰，劇烈攪拌下逐滴準(zhǔn)確滴加5.0mL1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，持續(xù)煮沸1h，溶液變?yōu)榛揖G色，冷卻后用蒸餾水補(bǔ)加到200mL。增強(qiáng)試劑配制用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。 3.1.4　 促凝劑：金溶膠的促凝劑：稱取5.85 g氯化鈉，溶于100 mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽溶液。銀溶膠的促凝劑：稱取5.85 g氯化鈉和2 g氫氧化鈉，溶于100 mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽溶液。 3.2　 參考物質(zhì) 三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見(jiàn)表1，純度≥99%。 表1 三聚氰胺中文名稱、英文名稱、CAS登記號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子質(zhì)量 三聚氰胺 Melamine 108-78-1 C3H6N6 126.12 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（500 μg/mL）：精密稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）適量，分別置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于4℃避光保存，有效期1個(gè)月。 4　 儀器和設(shè)備 4.1　 便攜式拉曼光譜儀 穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長(zhǎng)為785±1 nm，線寬<0.1 nm，能量≥250 mW；光譜分辨率≤15 cm-1；光譜響應(yīng)范圍500 cm-1~2000 cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。 4.2　 移液器：200 μL、1 mL和5 mL。 4.3　 渦旋振蕩器。 4.4　 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000 r/min。 4.5　 電子天平：感量為0.01 g。 4.6　 塑料具塞離心管：2 mL。 5　 分析步驟 5.1　 試樣的提取 取0.5 g樣品加到2 mL離心管中，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，渦旋30 s混勻；放入離心機(jī)，以不低于6000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min；上清液備用。 5.2　 測(cè)定步驟 5.2.1　 拉曼光譜儀器參考條件 激光能量≥250 mW，數(shù)據(jù)采集時(shí)間≥2 s。 5.2.2　 測(cè)定 在儀器樣品池中依次加入100 μL促凝劑，100 μL表面增強(qiáng)試劑，50 μL樣品（5.1），快速搖晃均勻，等待20 s檢測(cè)（檢測(cè)需在樣品加入后1 min內(nèi)完成）。 5.3　 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。 5.3.1　 空白試驗(yàn) 稱取空白試樣，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。 5.3.2　 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白試樣10 g置于15 mL具塞離心管中，加入50 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（500 μg/mL）（3.3），使三聚氰胺濃度為2.5 mg/kg，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。 6　 結(jié)果判定要求 儀器軟件將測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中的三聚氰胺進(jìn)行匹配計(jì)算，根據(jù)譜圖704 cm-1（±10 cm-1）處特征拉曼光譜及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中的三聚氰胺進(jìn)行結(jié)果判定：顯示測(cè)試結(jié)果并判定陰性或陽(yáng)性。陰性代表該樣品不含有三聚氰胺或低于2.5 mg/kg，陽(yáng)性則代表該樣品含有三聚氰胺且大于等于2.5 mg/kg。液態(tài)乳表面增強(qiáng)拉曼光譜圖參見(jiàn)圖1。 圖1 液態(tài)乳表面增強(qiáng)拉曼光譜圖 6.1　 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試樣測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。 7　 性能指標(biāo) 7.1　 檢測(cè)限 2.5mg/kg。 7.2　 靈敏度 靈敏度應(yīng)≥99%。 7.3　 特異性 特異性應(yīng)≥85%。 7.4　 假陰性率 假陰性率應(yīng)≤1%。 7.5　 假陽(yáng)性率 假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%。 注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。 8　 確證 本方法為初篩方法，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 9　 其他 本方法所述納米表面增強(qiáng)試劑及促凝劑信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 22388-2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》。 附錄A 快速檢測(cè)方法性能計(jì)算表 表A.1 性能指標(biāo)計(jì)算方法 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異(х2) c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽(yáng)性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法負(fù)責(zé)起草單位：江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。 驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、江南大學(xué)、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 主要起草人：徐春祥、張淵、張征、顏春榮、胡明燕、劉麗強(qiáng)、姚歡 — 5 —