2010年版中國藥典 生物檢定部分修訂內(nèi)容,高華 中國藥品生物制品檢定所,主要內(nèi)容,一、藥品生物檢定概況 二、藥品生物檢定增修訂情況,藥品生物檢定概況,定義 應(yīng)用范圍 作用,藥品生物檢定-定義,生物檢定法是利用生物體包括整體、離體組織、器官、細胞和微生物等評估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設(shè)計在一定條件下比較供試品和相當(dāng)?shù)臉?biāo)準品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過等反應(yīng)劑量間比例的運算或限值劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測定供試品的效價、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性。,藥品生物檢定,體內(nèi)測定（in vivo）-以整體動物生物體 體外測定（in bitro）-以離體器官、組織、微生物、酶和細胞（原代細胞、傳代細胞）為生物體，利用這些生物體評價藥品的生物活性（藥效、活力或毒力）,應(yīng)用范圍,藥品（生化藥品、中藥） 生物制品（疫苗、血液制品） 安全性檢查,應(yīng)用范圍,對從動物臟器、微生物或體液等提取的，有效成分不夠確切，多組分、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化方法不能有效鑒定并具有生物活性的天然生化藥物、中藥，以及有些生物技術(shù)藥物，由于空間結(jié)構(gòu)的細微變化，影響藥物的活性中心位點，目前質(zhì)量標(biāo)準中仍應(yīng)用生物檢定法評估藥物的生物活性。 如生化藥物：一般是從生物體分離、純化所得 如肝素鈉、魚精蛋白、促腎上腺皮質(zhì)激素。 中藥：洋地黃制劑、人工麝香、水蛭等。,藥品生物檢定作用,工藝與方法驗證 效價與活性 鑒別,作用工藝及方法驗證,對于新生產(chǎn)工藝、新檢測方法的改進、變更，往往需要生物檢定來驗證核對。中、外藥典在重組人生長激素（rhGH）重組人胰高血糖素質(zhì)量標(biāo)準中明確規(guī)定，在生產(chǎn)研發(fā)階段，“生產(chǎn)過程中的產(chǎn)品必須用體內(nèi)生物檢定方法測定其生物效價”，直到生產(chǎn)穩(wěn)定為止。,作用效價與活性,當(dāng)采用理化方法測定如HPLC替代胰島素等原有的生物效價測定法時，仍需作大量的方法比對、相關(guān)性研究等工作。,作用效價與活性,定量的測定方法 半定量的測定方法,定量的測定方法,效價（potency）測定是生物檢定的主要內(nèi)容，它是以藥理為基礎(chǔ)，生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設(shè)計，利用生物體在一定條件下比較供試品與相當(dāng)于標(biāo)準品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)（可測量、量化的生理指標(biāo)或生物藥效或毒力）的一種定量的方法，因而被稱為定量藥理學(xué)。,定量的測定方法,胰島素 縮宮素 肝素 卵泡刺激素 黃體生成素,升壓素 硫酸魚精蛋白 洋地黃 生長激素 降鈣素,半定量的測定方法（活性檢查）,當(dāng)理化測定占主導(dǎo)地位，效價測定一般來講可以不必精確，可歸于活性檢查項，采用半定量方法，設(shè)定限值，不需精密生物統(tǒng)計，盡可能減少實驗動物用量或其他生物體用量；甚至只用于定性的鑒別。例如：新藥重組人胰高血糖素類多肽是治療糖尿病用藥，其質(zhì)量標(biāo)準中即采用該法（限值為小鼠血糖降低大于20%）進行活性檢查。,鑒別,隨著對動物保護意識提高，對實驗動物減少、替代、優(yōu)化（3R：Reduction、Replacement、Refinement）的實施，對能用理化測定的藥品，生物效價測定逐漸降為鑒別項的定性或半定量測定。 如USP升壓素大鼠血壓升高法用于鑒別。2010年中國藥典縮宮素注射液將子宮收縮法放入鑒別項。,二、附錄生物檢定方法增修訂情況,附錄生物檢定方法增修訂情況 附錄增修訂主要特點 增修訂主要內(nèi)容,附錄生物檢定方法增修訂情況,附錄增修訂主要特點,中藥質(zhì)量控制評價模式轉(zhuǎn)變 充分驗證 完善提高 充分體現(xiàn)了“3R”原則,附錄增修訂主要特點,中藥質(zhì)量控制評價模式轉(zhuǎn)變 生物活性引入實現(xiàn)了中藥質(zhì)量標(biāo)準由單一指標(biāo)成分定性定量向活性有效成分及生物測定的綜合檢測。,附錄增修訂主要特點,充分驗證： 遵循科學(xué)性、合理性、可操作性，新建或新設(shè)立項目必須經(jīng)不同實驗室的共同驗證或適用性研究，如注射劑安全性指導(dǎo)原則對方法學(xué)的適用性研究；中藥生物活性指導(dǎo)原則要求對方法的專屬性、準確性、精密度（重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性）、適用性、科學(xué)性進行了研究。,附錄增修訂主要特點,完善提高 對2010藥典一、二部檢查法和指導(dǎo)原則進行修訂和改進，對影響結(jié)果準確性的實驗條件提出了要求，如熱原檢查法、溶血與凝聚、降壓物質(zhì)檢查法、過敏試驗。,附錄增修訂主要特點,體現(xiàn)了“3R”原則 如熱原檢查法取消家兔使用次數(shù)和體重上限規(guī)定。 中藥生物活性指導(dǎo)原則中對動物的使用等。,增修訂主要內(nèi)容,一、熱原檢查法 二、細菌內(nèi)毒素檢查法 三、異常毒性檢查法 四、溶血與凝聚檢查法 五、過敏反應(yīng)檢查法 六、降壓物質(zhì)檢查法 七、生物檢定統(tǒng)計法 八、中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則 九、化藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則 十、中藥生物活性測定指導(dǎo)原則,熱原檢查法,定義 2010 版與2005版區(qū)別 修訂背景 實驗用兔靈敏度測試 熱原檢查適用性研究,熱原檢查法,定義：本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。,2010 版與2005版區(qū)別,*三部仍規(guī)定，對血液制品、抗毒素和其他同一過敏原的供試品在5天內(nèi)可重復(fù)使用1次。,修訂背景,、熱原實驗是一個整體的動物實驗，易受許多因素的影響。動物自身的行為、生理、外部環(huán)境以及一些實驗過程等都可影響結(jié)果的準確性。 、對家兔體重取消了上限3.0kg，同時取消家兔使用次數(shù)不超過次的規(guī)定。,修訂背景,、增加了升溫達0.6 的家兔應(yīng)休息2 周以上新要求。 4、實驗環(huán)境要求更加嚴格：實驗室與飼養(yǎng)室溫度相差由不大于 5 改為3 5、強調(diào)同組各家兔間溫差不大于1 ，對家兔固定方式：寬松。 6、判定標(biāo)準更加嚴格：初試的3只家兔體溫升高總和低于 1.4 改為低于1.3 ,實驗用兔靈敏度測試,每年不定期隨機抽取體重和使用次數(shù)不同的實驗用兔，按熱原檢查法要求注射EU/kg或10EU/kg內(nèi)毒素標(biāo)準品，應(yīng)得到不符合規(guī)定的結(jié)果。,熱原檢查適用性研究,新品種建立熱原檢查標(biāo)準時，建議進行適用性研究，在不影響家兔正常生理的前提下，按人用每公斤體重每小時最大供試品劑量的倍設(shè)定限值。（化學(xué)藥品一般為倍，中藥為倍）。,熱原檢查適用性研究,適用性試驗時設(shè)三組：限值劑量的供試品組 10EU/kg內(nèi)毒素組含10EU/kg內(nèi)毒素的供試品組。 適用性試驗判定： 組符合規(guī)定， 、組不符合規(guī)定表明該品種可建立熱原檢查項。,二、細菌內(nèi)毒素檢查法,定義 2010版與2005版區(qū)別 修訂背景 注射用藥品、生物制品建立細菌內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則,二、細菌內(nèi)毒素檢查法,定義：本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。,2010版與2005版區(qū)別,修訂背景,1、細菌內(nèi)毒素與檢查用水除了強調(diào)內(nèi)毒素含量外，還強調(diào)應(yīng)對內(nèi)毒素試驗無干擾作用。 2、強調(diào)用干熱滅菌法（ 250、30分鐘以上）去除內(nèi)毒素與熱原法同步。 3、根據(jù)某些藥（如抗腫瘤藥）用體表面積計算給藥量的需要，增加了按體表面積給藥時的計算方法。,注射用藥品、生物制品建立細菌內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則,本原則依據(jù)2010年版藥典制訂，適用于注射用藥品、生物制品建立細菌內(nèi)毒素檢查項目時進行的實驗及研究。,需建立內(nèi)毒素檢查項目的品種,質(zhì)量標(biāo)準中有家兔熱原檢查法需轉(zhuǎn)換為細菌內(nèi)毒素檢查方法的品種。 用于注射給藥，但未有熱原質(zhì)量控制的品種。 注射用新藥需建立熱原質(zhì)量控制的品種。 用于靜脈給藥的原輔料,建立方法時對鱟試劑及樣品的要求,同時使用兩個鱟試劑廠家的鱟試劑 每個品種至少三批樣品（上市品種應(yīng)檢測兩個以上生產(chǎn)廠家；新藥需檢測連續(xù)生產(chǎn)的樣品）。,確定內(nèi)毒素限值,一般按公式L=K/M計算。M為人每公斤每小時臨床最大用藥劑量，依據(jù)藥品使用說明書，臨床用藥須知確定。 兒童用藥如大于成人，以兒童為準。 為保障安全用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品，可根據(jù)計算值適當(dāng)調(diào)整，嚴格至計算限值的1/2或1/3。 對于體積在100ml以上（包括100ml）的復(fù)方靜脈輸液類品種，內(nèi)毒素限值一般按0.5EU/ml計。其他單方靜脈輸液品種除另有規(guī)定外也可按用藥劑量計算，以EU/mg或EU/U表示。 對于美國、歐洲或日本藥典已收載的，并已建立細菌內(nèi)毒素檢查法的品種可參考國外藥典規(guī)定的限值，與按公式計算出的數(shù)值比較，以嚴格者為該品種的限值。如果使用的是國外藥典的限值，應(yīng)以最新版本藥典為準。,干擾實驗,建議使用較低靈敏度鱟試劑 (0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供試品中內(nèi)毒素的陽性影響。,三. 異常毒性檢查法,定義 2010版與2005版區(qū)別,三. 異常毒性檢查法,定義：本法系給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時間內(nèi)觀察小鼠出現(xiàn)的死亡情況，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法。,三. 異常毒性檢查法,異常毒性有別于藥物本身所具有的毒性特征，是指由生產(chǎn)過程中引入或其他原因所導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。 供試品如不合格，表明藥品中含有超過正常產(chǎn)品毒性的毒性雜質(zhì)，臨床用藥將可能增加急性不良反應(yīng)。,四. 溶血與凝聚檢查法,定義 2010版與2005版區(qū)別 修訂背景,四. 溶血與凝聚檢查法,定義：本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細胞混懸液混合，溫育一定時間后，觀察其對紅細胞狀態(tài)是否產(chǎn)生影響的一種方法。,修訂背景,1、考慮一般家兔容易得到，故將羊血刪去；采用兔紅細胞懸液； 2、2010版用輕輕倒轉(zhuǎn)3次來觀察凝聚，規(guī)范了操作； 3、在顯微鏡下見紅細胞凝集為凝聚，簡單明確； 4、同時觀察1、2號兩個平行管與5號管的對比，來判定是否溶血； 5、考慮藥物與一次性試管（高分子材料）的相容性，強調(diào)用玻璃試管。,五. 過敏反應(yīng)檢查法,定義 2010版與2005版區(qū)別 修訂背景,五. 過敏反應(yīng)檢查法,定義：本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內(nèi)，間隔一定時間后靜脈注射供試品溶液進行激發(fā)，觀察動物出現(xiàn)過敏反應(yīng)的情況，以判定供試品是否引起動物全身過敏反應(yīng)。,2010 版與2005版區(qū)別,修訂背景,1、適宜的途徑考慮對腹腔有刺激性的藥物不適宜腹腔注射； 2、強調(diào)同一只動物上； 3、增加部分嚴重的反應(yīng)指標(biāo)。,六. 降壓物質(zhì)檢查法,定義 2010 版與2005版區(qū)別 修訂背景,六. 降壓物質(zhì)檢查法,定義：本法系比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定,2010 版與2005版區(qū)別,2010 版與2005版區(qū)別,修訂背景,1、強調(diào)對照品的降壓活性要符合要求 2、強調(diào)貓的正常血壓范圍為13.320.0kPa 3、強調(diào)每次注射應(yīng)在前一次反應(yīng)恢復(fù)穩(wěn)定以后進行，而不強調(diào)要35分鐘之內(nèi)。,七. 生物檢定統(tǒng)計法,定義：生物檢定統(tǒng)計法主要敘述的是應(yīng)用生物檢定時必須注意的基本原則、一般要求、實驗設(shè)計及統(tǒng)計方法。,2010 版與2005版區(qū)別,2010 版與2005版區(qū)別,12、對結(jié)果不均一時進行了舉例：如胰島素測定結(jié)果不均一時計算表及計算方法,修訂背景,1、生物檢定法的概念 2、可信限率的定義及公式 3、（42）、（43）公式修訂 4、Sm2 (各次實驗差方)及W(校正權(quán)重)的定義 5、合并計算時lgPT,八. 中藥注射劑安全性檢查法 應(yīng)用指導(dǎo)原則,八. 中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則,中藥安全性檢查項目的設(shè)定 安全性檢查方法和檢查限值確定,八. 中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則,本指導(dǎo)原則為中藥注射劑臨床使用的安全性和制劑質(zhì)量可控性而定。 中藥注射劑安全性檢查包括：熱原（或細菌內(nèi)毒素）、異常毒性、降壓物質(zhì)、過敏反應(yīng)物質(zhì)、溶血與凝聚等項。 根據(jù)處方、工藝、用法及用量等設(shè)定相應(yīng)檢查項目 進行適用性研究。,（一）中藥安全性檢查項目的設(shè)定,靜脈用注射劑：應(yīng)設(shè)熱原（或細菌內(nèi)毒素）、異常毒性、過敏反應(yīng)、溶血與凝聚等安全性檢查項，必要時考慮降壓物質(zhì)檢查項。（功能主治中具有與升壓相關(guān)內(nèi)容的注射劑除外） 中藥注射劑中致熱成分復(fù)雜，可能干擾細菌內(nèi)毒素檢查，一般首選熱原檢查項，如該藥本身具有清熱的藥理作用或?qū)彝糜卸拘苑磻?yīng)，也可選擇細菌內(nèi)毒素檢查項。 肌內(nèi)注射用注射劑： 應(yīng)設(shè)異常毒性、過敏反應(yīng)等檢查項。,（二）安全性檢查方法和檢查限值確定,方法適用性（設(shè)定限值前研究） 確定限值 應(yīng)進行三批以上供試品的檢查驗證,1.熱原-細菌內(nèi)毒素檢查,方法適用性（設(shè)定限值前研究） 熱原檢查應(yīng)做適用性研究，求得對家兔無毒性反應(yīng)、不影響正常體溫和無解熱作用的劑量。 細菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)進行干擾試驗，求得 最大無干擾濃度。 檢查方法 參照熱原檢查法（附錄 A）或細菌內(nèi)毒素檢查法（附錄 D）。 品種項下可以增加稀釋濃度、調(diào)節(jié)pH和滲透壓或緩慢注射等排除干擾或影響的特殊規(guī)定。,設(shè)定限值-熱原檢查,限值根據(jù)臨床一小時內(nèi)最大用藥劑量計算。 熱原檢查限值可參照臨床劑量計算，一般為人用每公斤體重每小時最大供試品劑量的35倍， 供試品注射體積每公斤體重一般不少于0.5mL，不超過10mL。 限值劑量應(yīng)不影響正常體溫。,設(shè)定限值-內(nèi)毒素檢查,限值根據(jù)臨床一小時內(nèi)最大用藥劑量計算 內(nèi)毒素檢查限值按規(guī)定要求計算， 由于藥物和適應(yīng)癥 (如抗感染、抗腫瘤、心血管藥等急重病癥用藥、兒童老人用藥、復(fù)合用藥、大輸液等) 的不同，限值可適當(dāng)嚴格，至計算值的1/31/2，以保證安全用藥。 細菌內(nèi)毒素測定濃度應(yīng)無干擾反應(yīng)。,2.異常毒性檢查,方法適用性（設(shè)定限值前研究） 可參考文獻數(shù)據(jù)，并經(jīng)單次靜脈注射給藥毒性試驗確定該注射劑的急性毒性數(shù)據(jù)（LD50或LD1及其可信限）。 可由多個實驗室或多種來源動物試驗求得LD50和LD1數(shù)據(jù)。 注射速度0.1ml/秒，觀察時間為72小時。 如其它給藥途徑或延長觀察時間應(yīng)進行相應(yīng)途徑或相應(yīng)觀察時間的急性毒性試驗。 檢查方法 參照異常毒性檢查法（附錄 E ）。 對動物、給藥途徑和給藥次數(shù) 、觀察指標(biāo)和時間等，方法和限值有特殊要求時，可在品種項下另作規(guī)定。,設(shè)定限值,限值應(yīng)低于該注射劑本身毒性的最低致死劑量 考慮到實驗室間差異、動物反應(yīng)差異和制劑的差異，建議 限值至少應(yīng)小于LD1可信限下限的1/3(建議采用1/31/6)， 如難以計算最低致死量，可采用LD50可信限下限的1/4 (建議采用1/41/8)。 如半數(shù)致死量與臨床體重劑量之比小于20，可采用LD50可信限下限的1/4或LD1可信限下限的1/3。 靜脈注射最大劑量0.8ml/20g仍未見毒性反應(yīng)或死亡，可以此作為檢查限值。,3.降壓物質(zhì)檢查,方法適用性（設(shè)定限值前研究） 供試品按一定注射速度靜脈注射不同劑量，觀察供試品對貓血壓反應(yīng)的劑量反應(yīng)關(guān)系。 供試品與對照品注射體積應(yīng)相同，通常為0.21ml/kg，求得供試品降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定的最大劑量（最大無降壓反應(yīng)劑量）。 檢查方法 參照降壓物質(zhì)檢查法（附錄 F）。,設(shè)定限值,臨床單次用藥劑量的1/55倍作為降壓反應(yīng)物質(zhì)檢查劑量限值，急重病癥用藥盡可能采用高限。 特殊情況下，如供試品有一定降壓作用，則可按最大無降壓反應(yīng)劑量的1/2-1/4作為限值劑量。 供試品原液靜脈注射1ml/kg劑量未見降壓反應(yīng)，該劑量可作為給藥限值,4. 過敏反應(yīng)檢查,方法適用性（設(shè)定限值前研究） 測定供試品對豚鼠腹腔 (或皮下)和靜脈給藥的無毒性反應(yīng)劑量。 可采用注射劑的半成品原輔料進行致敏和激發(fā)研究，確定致敏方式和次數(shù) 在首次給藥后14、21、28天中選擇最佳激發(fā)時間。 檢查方法 參照過敏反應(yīng)檢查法（附錄 G）。,設(shè)定限值,致敏和激發(fā)劑量應(yīng)小于該途徑的急性毒性反應(yīng)劑量, 適當(dāng)參考臨床劑量 一般激發(fā)劑量大于致敏劑量。 常用腹腔或鼠鼷部皮下注射途徑致敏，每次每只0.5ml, 每只1ml靜脈注射激發(fā)。 如致敏劑量較小，可適當(dāng)增加致敏次數(shù)，方法和限值的特殊要求應(yīng)在品種項下規(guī)定。,5.溶血與凝聚檢查,方法適用性（設(shè)定限值前研究） 對注射劑原液和稀釋液進行溶血與凝聚實驗研究, 指標(biāo)除目測外，可增加比色法和顯微鏡下紅細胞計數(shù)方法, 確定無溶血和或凝聚的最大濃度 檢查方法 參照溶血與凝聚檢查法（附錄 H）。,設(shè)定限值,以無溶血和凝聚的最大濃度的1/2作為限值濃度 一般應(yīng)高于臨床最大使用濃度。,修訂背景,1、增加了中藥安全性檢查項目的設(shè)定原則。 2、增加了限制前研究（即方法適用性研究），使方法更具科學(xué)性、可操作性。 3、安全性檢查法內(nèi)容省略，檢查限值設(shè)定更加具體明確。 4、家兔熱原檢查法檢查限值由人用每公斤體重每小時最大供試品劑量的1-3倍修改為3-5倍。,九. 化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法 應(yīng)用指導(dǎo)原則,化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法 應(yīng)用指導(dǎo)原則,化學(xué)藥品（包括抗生素、生化藥品）安全性檢查項目的設(shè)定 安全性檢查方法和檢查限值確定 化藥與中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則的異同點,化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法 應(yīng)用指導(dǎo)原則,本指導(dǎo)原則為化學(xué)藥品注射劑臨床使用的安全性和制劑質(zhì)量可控性而定。 化學(xué)藥注射劑安全性檢查包括異常毒性、細菌內(nèi)毒素（或熱原）、降壓物質(zhì)（或組胺物質(zhì)）、過敏反應(yīng)等項。 根據(jù)處方、工藝、用法及用量等設(shè)定相應(yīng)的檢查項目 進行適用性研究。,（一）化學(xué)藥品（包括抗生素、生化藥品）安全性檢查項目的設(shè)定,1、靜脈用注射劑 應(yīng)設(shè)細菌內(nèi)毒素（或熱原）檢查項。 所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵液提取物，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染毒性雜質(zhì)，且又缺乏有效的理化分析方法的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立異常毒性檢查項。,安全性檢查項目的設(shè)定,1、靜脈用注射劑 所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵提取物時,組分結(jié)構(gòu)不清晰，且有可能污染異源蛋白或未知過敏反應(yīng)物質(zhì)的靜脈用注射劑，如缺乏相關(guān)的理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立過敏反應(yīng)檢查項。 所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵提取物時, 組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染組胺、類組胺樣降血壓物質(zhì)的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立降壓物質(zhì)或組胺類物質(zhì)檢查項。,安全性檢查項目的設(shè)定,2、肌內(nèi)注射用注射劑 所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵提取物時, 組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染毒性雜質(zhì)，且又缺乏有效的理化分析方法的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立異常毒性檢查項。,安全性檢查項目的設(shè)定,2、肌內(nèi)注射用注射劑 所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵提取物時, 組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染異源蛋白或未知過敏反應(yīng)物質(zhì)的肌內(nèi)注射用注射劑，如缺乏相關(guān)理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立過敏反應(yīng)檢查項。 臨床用藥劑量較大，生產(chǎn)工藝易污染細菌內(nèi)毒素的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)細菌內(nèi)毒素檢查項,安全性檢查項目的設(shè)定,3、特殊途徑的注射劑 椎管內(nèi)、腹腔、眼內(nèi)等特殊途徑的注射劑，其安全性檢查項目一般應(yīng)符合靜脈用注射劑的要求， 必要時增加其它安全性檢查項目，如刺激性檢查、細胞毒性檢查。,安全性檢查項目的設(shè)定,4、注射劑輔料 注射劑輔料使用面廣，用量大，來源復(fù)雜，與藥品的安全性直接相關(guān)。 在質(zhì)量控制中，應(yīng)根據(jù)輔料來源、性質(zhì)、用途、用法用量，配合理化分析方法，設(shè)立必要的安全性檢查項目。,安全性檢查項目的設(shè)定,5、其它 原料和生產(chǎn)工藝特殊的注射劑必要時應(yīng)增加特殊的安全性檢查項目，如病毒檢查、細胞毒性檢查等。,（二）安全性檢查方法和檢查限值確定 -組胺檢查法,定義：本法系將一定濃度的供試品和組胺對照品分別觀察出現(xiàn)的收縮反應(yīng)幅度并加以比較，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法。 不合格供試品表明含有組胺和類組胺物質(zhì)，在臨床上可能引起血壓下降和類似過敏反應(yīng)等嚴重的不良反應(yīng)。,（二）安全性檢查方法和檢查限值確定 -組胺檢查法,檢查方法 參照本附錄“附 組胺類物質(zhì)檢查法” 設(shè)定限值前研究 在確定限值前，應(yīng)考察供試品對組胺對照品引起的離體豚鼠回腸收縮反應(yīng)的干擾（抑制或增強），求得最大無收縮干擾濃度。 若供試品的處方、生產(chǎn)工藝等任何有可能影響試驗結(jié)果的條件發(fā)生改變時，需重新進行干擾試驗。,組胺檢查法,干擾試驗 按組胺類物質(zhì)檢查法，依下列順序準確注入供試品稀釋液加對照品稀釋液低劑量、對照品稀釋液低劑量、供試品稀釋液加對照品稀釋液高劑量、對照品稀釋液高劑量（dSL+T、dSL 、dSH+T、dSH ），重復(fù)一次，如dSL+T及dSH+T所致的反應(yīng)值與dSL及dSH所致的反應(yīng)值基本一致，可認為供試品不干擾組胺物質(zhì)檢查；同時應(yīng)進行本法與降壓物質(zhì)檢查法符合性的研究。否則該品種不適合設(shè)立組胺物質(zhì)檢查項，建議設(shè)立降壓物質(zhì)檢查項。,組胺檢查法,限值確定 除特殊要求外，原則上與降壓物質(zhì)檢查限值一致，以臨床單次用藥劑量的1/55倍量和每千克體重0.1g組胺劑量計算注射劑含組胺類物質(zhì)檢查限值，其計算公式為：限值L=K/M，其中K值為人每千克體重接受的組胺量（0.1g/kg），M為降壓物質(zhì)檢查限值（mg/kg、ml/kg、IU/kg）。供試品劑量應(yīng)低于最大無收縮干擾劑量。抗腫瘤藥、心血管病藥等急重病癥用藥應(yīng)采用高限。,組胺類物質(zhì)檢查法,定義 本法系比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起豚鼠離體回腸收縮的程度，以判定供試品中含組胺類物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。,增訂背景,1降壓物質(zhì)檢查法使用的動物為貓，現(xiàn)在貓來源復(fù)雜、而且難以得到，動物數(shù)量、質(zhì)量都難以保證。因此使用組胺檢查法作為體外替代方法。,增訂背景,2許多中藥注射劑品種在做降壓物質(zhì)檢查時，存在一過性降壓現(xiàn)象，如清開靈注射液、復(fù)方苦參注射液等，但在臨床使用時并不存在降壓現(xiàn)象； 還有一些活血化瘀類中藥注射劑品種如紅花注射液，丹參注射液，紅花黃色素注射液等，本身具有擴張血管的作用，在做降壓物質(zhì)檢查時，在與臨床劑量等同的情況下，血壓出現(xiàn)大幅度下降的情況。究其原因，是中藥注射劑的成分復(fù)雜，還是其本身擴張血管的作用，尚不清楚。 因此，在中藥注射液的安全性評價中是否增加降壓物質(zhì)檢查項一直存在爭議。,增訂過程,組胺檢查法是豚鼠離體回腸收縮法在藥品檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用。豚鼠離體回腸收縮法本身是一種成熟的藥理實驗方法，在基礎(chǔ)藥理研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其作用機制、拮抗劑與激動劑的類型與劑量等基礎(chǔ)研究均細致深入。本法在借鑒的基礎(chǔ)上，對試驗條件、結(jié)果判定等進行了明確與改良。,附 組胺檢查法,營養(yǎng)液組成特點 A 液：試驗當(dāng)日，取氯化鈉160.0g、氯化鉀4.0g、氯化鈣（按無水物計算）2.0g、氯化鎂（按無水物計算）1.0g 與磷酸氫二鈉（含12 個結(jié)晶水）0.10g，加注射用水700ml 使溶解，再加入注射用水適量，使成1000ml。 B 液：取硫酸阿托品0.5mg、碳酸氫鈉1.0g、葡萄糖（含1 個結(jié)晶水）0.5g，加適量注射用水使溶解，加A 液50.0ml，混合后加注射用水使成1000ml。B 液應(yīng)臨用前配制，并在24h 內(nèi)應(yīng)用。,結(jié)果判定方法,如供試品溶液引起回腸收縮： 則分別計算dSL、dT 所致反應(yīng)的平均值。 若dT 所致反應(yīng)的均值不大于dSL 所致反應(yīng)的均值，即判定供試品組胺類物質(zhì)檢查符合規(guī)定； 若dT 所致反應(yīng)的均值大于dSL所致反應(yīng)的均值，即判定供試品組胺類物質(zhì)檢查不符合規(guī)定。,結(jié)果判定方法,如供試品不引起回腸收縮： 則在供試品溶液中加入組胺對照品高、低劑量，并按下列次序準確注入dSH、dSL+T、dSH+T、dSL, 重復(fù)一次。 若供試品組胺溶液產(chǎn)生的收縮與對應(yīng)組胺對照液高、低劑量的收縮基本一致，可判定供試品組胺類物質(zhì)檢查符合規(guī)定； 若供試品組胺溶液產(chǎn)生的收縮與對應(yīng)組胺對照液高、低劑量產(chǎn)生的收縮不相符，即減少或無收縮，或不能重復(fù)出現(xiàn)，則此檢查結(jié)果無效，應(yīng)進行供試品的降壓物質(zhì)檢查。,技術(shù)要求與注意事項,動物要求 1、實驗證實純種動物對組胺的反應(yīng)更為靈敏，收縮值高，靈敏度也較為穩(wěn)定。因此使用純種動物是保證實驗順利的基礎(chǔ)。 2、動物體重應(yīng)嚴格控制在250-350g，動物體重過大、過小靈敏度均難以重復(fù)。 3、禁食時間對豚鼠的腸道平滑肌功能有直接影響，故動物禁食應(yīng)控制在24h左右，禁食后未使用的動物近期內(nèi)不應(yīng)用于本實驗。,技術(shù)要求與注意事項,腸管處置 1、剖腹取出回腸一段（選用遠端小腸，因為此段最敏感），注意避免因牽拉使回腸受損，腸系膜不必要全部分離，容易損傷腸管，少帶一些血管組織，腸管更有活力。 2、新鮮取出的腸管宜立刻浸泡至營養(yǎng)液B中。 3、腸管剪取23cm長，具體長度應(yīng)依據(jù)浴桶高度取舍。,技術(shù)要求與注意事項,4、剪取后立即使其在營養(yǎng)中平衡一段時間，并在20分鐘內(nèi)開始給予組胺。 5、離體腸管可以保存于B液中，至2-8冰箱中冷藏，通入氧氣，24h內(nèi)可以使用。冰箱中保存的離體腸管使用時宜掛在浴桶內(nèi)1h左右后再開始試驗。,技術(shù)要求與注意事項,預(yù)負荷 對于準確記錄組胺引起的回腸收縮值十分重要，調(diào)零后應(yīng)預(yù)加負荷1g左右，調(diào)節(jié)使其對收縮的反應(yīng)最為靈敏。在腸管平衡的過程中，因腸管松弛，預(yù)加的負荷值會降低，必要時應(yīng)調(diào)整使其對收縮的反應(yīng)最為靈敏。但在確定了dSH、dSL后，則不應(yīng)調(diào)整，否則可能引起dSH、dSL的收縮高度改變，失去意義。,技術(shù)要求與注意事項,干擾的判斷 干擾的判斷是試驗過程的重要影響因素。試驗中有時靈敏度的下降與樣品干擾引起的回腸收縮降低難以區(qū)分，應(yīng)靜置或沖洗浴筒使靈敏度恢復(fù)后重新試驗。,技術(shù)要求與注意事項,建議先取一段腸管，以組胺對照液10-9、10-8、10-7、10-6g/ml依次給予，觀察腸管收縮，以確定所用動物的最佳劑量范圍；要注意的是如果組胺對照液的濃度過高，有可能使腸管收縮難以恢復(fù)，應(yīng)更換腸管。,（三）化藥與中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則的異同點,1.安全性檢查法和檢查限值確定中異常毒性檢查、細菌內(nèi)毒素、熱原檢查、降壓物質(zhì)檢查、過敏反應(yīng)檢查兩者一致。 2.化學(xué)安全性檢查項目設(shè)定原則中增加了特殊途徑的注射劑、注射劑輔料及其它。 3.化學(xué)注射劑增加了組胺類物質(zhì)檢查項,而中藥注射劑增加了溶血與凝聚檢查。,十、中藥生物活性測定指導(dǎo)原則,生物活性測定法是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設(shè)計，測定藥物有效性的一種方法，從而達到控制藥品質(zhì)量的作用。 其測定方法包括生物效價測定法和生物活性限值測定法。,概 念,控制中藥有效性的一種方法； 方法基礎(chǔ)：生物效應(yīng)； 方法工具：統(tǒng)計學(xué)； 目的：控制質(zhì)量； 分類：定量法生物效價測定法 定性法生物活性限值測定法,背 景,中藥的藥材來源廣泛、多變，制備工藝復(fù)雜，使得中藥制劑的質(zhì)量控制相對困難 中藥往往含有多種活性成分和具有多種藥理作用，僅僅控制少數(shù)成分不能完全控制其質(zhì)量和反映臨床療效 為了使中藥的質(zhì)量標(biāo)準能更好地保證每批藥品的臨床使用安全有效，有必要在現(xiàn)有含量測定的基礎(chǔ)上增加生物活性測定，以綜合評價其質(zhì)量。,（一）基本原則,符合藥理學(xué)研究基本原則 應(yīng)符合藥理學(xué)研究隨機、對照、重復(fù)的基本原則；具備簡單、精確特點；判斷標(biāo)準應(yīng)明確。 體現(xiàn)中醫(yī)藥特點 建立的方法，其測定指標(biāo)應(yīng)與該中藥的“功能與主治”相一致。 品種選擇合理 研究的中藥材或中成藥應(yīng)功能主治明確， 優(yōu)先考慮適應(yīng)癥明確，成分單一的中藥注射劑品種，對急重癥用藥、保護品種應(yīng)重點進行研究。 方法科學(xué)可靠 優(yōu)先選用生物效價測定法，不能建立生物效價測定的品種可考慮采用生物活性限值測定法,體現(xiàn)中醫(yī)藥特色,難度大； 判定指標(biāo)和中醫(yī)的“功能主治”如何銜接？ 多功能主治中藥指標(biāo)的選擇。,品種選擇合理,功能主治明確； 適應(yīng)癥單一； 中藥注射劑； 急重癥用藥； 保護品種； 新藥？,方法科學(xué)可靠,生物效價法 生物活性限值測定法,（二）基本內(nèi)容,1、實驗條件 試驗系選擇 供試品選擇 標(biāo)準品或?qū)φ掌愤x擇,試驗系的選擇,應(yīng)與試驗原理和測定指標(biāo)密切相關(guān)； 背景資料清楚、影響因素少、檢測指標(biāo)靈敏、成本低廉； 實驗動物的要求。 盡可能使用小鼠和大鼠，應(yīng)遵循“優(yōu)化、減少、替代”的“3R”原則。,供試品的選擇,工藝穩(wěn)定、質(zhì)量合格（目前的標(biāo)準要求）； 飲片應(yīng)基源清楚； 使用三批供試品（方法學(xué)研究時）。,標(biāo)準品和對照品選擇,首選中藥標(biāo)準品； 可考慮化學(xué)藥作為對照品； 生物效價測定法必須要有標(biāo)準品測定相對效價；生物活性限值測定法用對照品作為驗證。,2、實驗設(shè)計,設(shè)計原理 設(shè)計類型 劑量設(shè)計 給藥途徑 給藥次數(shù) 指標(biāo)選擇,設(shè)計原理,所選實驗方法的原理應(yīng)明確； 所選擇的檢測指標(biāo)應(yīng)客觀、專屬性強； 能夠體現(xiàn)供試品的功能與主治或藥理作用； 如果選擇機理研究也應(yīng)考慮指標(biāo)的專屬性,設(shè)計類型,采用生物效價測定法，應(yīng)按中國藥典二部附錄“生物檢定統(tǒng)計法”的要求進行實驗設(shè)計研究； 采用生物活性限值測定法，試驗設(shè)計可考慮設(shè)供試品組、陰性對照組或陽性對照組， 測定方法需建立動物模型時，應(yīng)考慮設(shè)置模型對照組。重現(xiàn)性好的試驗，也可以不設(shè)或僅在復(fù)試時設(shè)陽性對照組。,劑量設(shè)計,如采用生物效價測定法，供試品和標(biāo)準品均采用多劑量組試驗，并按生物檢定的要求進行合理的劑量設(shè)計，使不同劑量之間的生物效應(yīng)有顯著性差異。 如采用生物活性限值測定法，建議只設(shè)一個限值劑量，限值劑量應(yīng)以產(chǎn)生生物效應(yīng)為宜；但在方法學(xué)研究時，應(yīng)采用多劑量試驗，充分說明標(biāo)準中設(shè)定限值劑量的依據(jù)。,給藥途徑,一般應(yīng)與臨床用藥途徑一致。 如采用不同的給藥途徑，應(yīng)說明理由。,給藥次數(shù),根據(jù)藥效學(xué)研究合理設(shè)計給藥次數(shù)； 可采用多次或單次給藥,指標(biāo)選擇,應(yīng)客觀、明確、專屬性強； 與“功能主治”基本一致； 功能主治多時應(yīng)如何選擇？ 如何體現(xiàn)與功能主治基本一致？,3、結(jié)果與統(tǒng)計,試驗結(jié)果評價應(yīng)符合生物統(tǒng)計要求。生物效價測定法應(yīng)符合中國藥典二部附錄“生物檢定統(tǒng)計法”的要求，根據(jù)樣品測定結(jié)果的變異性決定效價范圍和可信限率（FL）限值； 生物活性限值測定法，應(yīng)對誤差控制進行說明，明確試驗成立的判定依據(jù)，對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，并說明具體的統(tǒng)計方法和選擇依據(jù)。,判定標(biāo)準,生物效價測定，應(yīng)按品種的效價范圍和可信限率（FL）限值進行結(jié)果判斷； 生物活性限值測定，應(yīng)在規(guī)定的限值劑量下判定結(jié)果； 初試結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義者，可判定為符合規(guī)定； 初試結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)意義者，可增加樣本數(shù)進行一次復(fù)試，復(fù)試時應(yīng)增設(shè)陽性對照組，復(fù)試結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，判定為符合規(guī)定，否則為不符合規(guī)定。,（三）方法學(xué)驗證,測定方法影響因素考察 精密度考察 方法適用性考察,測定方法影響因素考察,應(yīng)考察測定方法的各種影響因素，通過考察確定最佳的試驗條件，以保證試驗方法的專屬性和準確性。 根據(jù)對影響因素考察結(jié)果，規(guī)定方法的誤差控制限值或?qū)y(tǒng)計有效性進行說明。,精密度考察,重復(fù)性 按確定的測定方法，用3批供試品、每批3次或同批供試品進行6次測定試驗后對結(jié)果進行評價。生物活性測定試驗結(jié)果判斷應(yīng)基本一致。 中間精密度 考察實驗室內(nèi)部條件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日和實驗時間）對測定結(jié)果的影響，至少應(yīng)對同實驗室改變?nèi)藛T進行考察。 重現(xiàn)性 生物活性測定試驗結(jié)果必須在3家以上實驗室能夠重現(xiàn)。,方法適用性考察,由生產(chǎn)企業(yè)按擬采用的生物活性測定方法和劑量對10批以上該產(chǎn)品進行內(nèi)部質(zhì)量控制測定，以積累數(shù)據(jù)，考察質(zhì)量標(biāo)準中該測定項目的適用性。 藥品檢驗研究機構(gòu)應(yīng)收集不同生產(chǎn)企業(yè)的同種產(chǎn)品進行生物活性比較研究。,起草背景,中藥質(zhì)量控制模式的歷史和現(xiàn)狀 必要性,中藥質(zhì)量控制模式歷史現(xiàn)狀,大致分為三個階段：外觀形態(tài)鑒別為主和內(nèi)在成分監(jiān)測為主。 第一階段 1985 年前，包括傳統(tǒng)的外觀形態(tài)鑒別（即經(jīng)典的看、嗅、嘗、試、量五法）和顯微鑒別，沒有確切的定量指標(biāo)，缺乏專屬性鑒別項目。 第二階段 1985 年后，中藥質(zhì)量控制向微觀內(nèi)在成分監(jiān)測的方向發(fā)展，開始使用化學(xué)和儀器分析的方法來對中藥成分進行鑒別和含量測定。 薄層色譜法的應(yīng)用，實現(xiàn)了中藥的專屬性鑒別；現(xiàn)代儀器分析方法來測定中藥活性成分和指標(biāo)成分的含量，結(jié)束了中藥質(zhì)量標(biāo)準中沒有定量指標(biāo)的歷史。,中藥質(zhì)量控制模式階段,第三階段 近年來，歐共體在草藥質(zhì)量指南中稱：草藥及其制劑是以整體為活性物質(zhì)，單靠測定其中的某種有效成分來考查質(zhì)量的穩(wěn)定性是不夠的。因此，具有“整體”特征的指紋圖譜檢測方法得到推廣，中藥質(zhì)量控制由單一指標(biāo)成分定性定量向活性有效成分及生物測定的綜合檢測的方向發(fā)展，是中藥質(zhì)量控制的里程碑。,起草背景,必要性 中藥成分的復(fù)雜多變不確定性導(dǎo)致生物活性的變化 中藥質(zhì)量標(biāo)準的局限性 現(xiàn)行的中藥質(zhì)量標(biāo)準主要是參照化學(xué)合成藥模式，通過某一個或幾個指標(biāo)有效成分的定性檢測與含量測定來對中藥的質(zhì)量加以控制。由于該指標(biāo)成分不一定是藥品的藥效成分或?qū)傩猿煞郑词篂橹饕幮С煞?，且其低微的含量限度與臨床有效劑量間缺乏相關(guān)性，其量效關(guān)系、毒效關(guān)系目前尚不清楚。 質(zhì)量控制的需要,中藥生物活性應(yīng)用及方法局限性,生物活性影響因素 1、應(yīng)用的局限性 不是所有中藥都適合采用用生物活性測定 中藥作用機制的復(fù)雜性，多靶點； 藥理作用比較溫和與遲緩，導(dǎo)致采用方法靈敏度較低； 2、方法的局限性 造模型的選擇：功能主治多 成本高，時間相對長：實驗動物消耗或材料多。有些造模型和給藥需要幾天時間。 生物誤差較大：由于受實驗條件(如動物性別、窩別，細胞活力等)因素的影響，尤其體內(nèi)測定法，重現(xiàn)性差，精密度低，且量效相關(guān)性不好，因此不宜采用生物效價法； 對照品的選擇難度,中藥生物活性應(yīng)用與方法局限性,對照品的選擇-需解決難題 由于中藥成分復(fù)雜性，多組分。如何正確選擇事關(guān)實驗的成敗。 已知一種有效成分？ 對照藥材？ 中藥提取物精制品？ 具有明確和藥理作用相一致的中藥？化學(xué)藥？,謝謝,