SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,生化社團(tuán) 呂炎,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理 三、實(shí)驗(yàn)步驟 四、結(jié)果分析 五、注意事項(xiàng),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,SDS的性質(zhì)與作用 聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì),SDS的性質(zhì)與作用,十二烷基磺酸鈉(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+,Protein Strand,SDS Molecules,Denature,SDS的性質(zhì)與作用,蛋白質(zhì)變性 0.1-1% SDS 0.1 M 2-巰基乙醇 蛋白質(zhì)變與SDS分子按比例結(jié)合 1 ：1.4,SDS,SDS的性質(zhì)與作用,聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì),聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的。,聚丙烯酰胺凝膠(PAG)具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對(duì)樣品的分離取決于各組分所帶電荷的多少及分子大小。 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)還具有濃縮效應(yīng)，即在電泳開始階段，由于不連續(xù)pH梯度作用，將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。,聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì),X,Y,Z,+ SDS,PAGE,SDS-PAGE,-,+,-,結(jié)果受分子量大小和電荷的影響,結(jié)果只與分子量大小有關(guān),-,+,PAGE和SDS-PAGE的比較,三、實(shí)驗(yàn)步驟,制備分離膠 制備濃縮膠 電泳及染色 凝膠板剝離與染色,配制分離膠溶液,制備分離膠,凝膠配制過(guò)程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入。注膠過(guò)程要一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。,加入分離膠溶液 pH 8.8,制備分離膠,封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。,配制濃縮膠溶液,制備濃縮膠,分離膠 pH 8.8,制備濃縮膠,濃縮膠 pH 8.6,分離膠 pH 8.8,上樣及電泳,開始電流恒定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。,凝膠板剝離與染色,電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色1小時(shí)左右。 脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分.,影響電泳速度的外界因素,1.電場(chǎng)強(qiáng)度 2.溶液的pH值 3.溶液的離子強(qiáng)度 4.電滲現(xiàn)象 5.溫度的影響 6.支持物的影響,四、結(jié)果分析,標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。,以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量。,五、注意事項(xiàng),1.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，操作時(shí)應(yīng)免避沾在臉、手等皮膚上。最好戴一次性塑料手套操作。 2.過(guò)硫酸銨的主要作用是提供自由基引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合反應(yīng)，故一定要新鮮，貯存過(guò)久的過(guò)硫酸銨商品不能使用。此外，10%過(guò)硫酸銨必須現(xiàn)用現(xiàn)配，4冰箱貯存不超過(guò)48小時(shí)。 3.灌制凝膠時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生汽泡，因?yàn)槠輹?huì)影響電泳分離效果。 4.剛灌注分離膠混合溶液后，應(yīng)在分離膠液面上加12cm高的水層，以阻隔空氣。膠液面上加水層時(shí)要特別小心，緩緩疊加，以免沖壞凝膠的膠面。 5.聚丙烯酰胺凝膠電泳耗時(shí)長(zhǎng)，電泳過(guò)程中產(chǎn)熱多，特別是夏天產(chǎn)熱更多。故電泳過(guò)程中應(yīng)安裝循環(huán)冷卻水以帶走熱量，或在4冰箱中電泳。,