專題2 微生物的培養(yǎng)與應用,了解有關微生物及培養(yǎng)基的基礎知識，進行無菌技術的操作，進行微生物的培養(yǎng)。,一、課題目標：,掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。,無菌技術的操作。,二、課題重點和難點：,三、技能目標：,微生物包括哪五類：,病毒 細菌 放線菌 真菌 原生動物,特點：結構簡單,形體微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.且體內一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,一、基礎知識： (一)微生物,細菌的外形與大小,細菌：單細胞不分枝的原核微生物。 細菌細胞微小而透明，通常用適當染料染色后顯微鏡觀察,圖1-1 常見的三種細菌典型形態(tài) A.球菌 B.桿菌 C.弧菌,細菌細胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細胞壁、細胞膜、細胞質，細胞質中又有液泡、儲存性顆粒、核質等。,細菌的構造,圖1-3 細菌的結構,*細胞壁,結構特點：堅韌且有彈性 細胞壁有哪些功能？ 固定細胞外形；,保護細胞免受外力的損傷；,阻攔大分子物質進人細胞；,使細胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。,傷寒桿菌細胞壁中含毒素,芽孢,有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.,學車問答 學車問題回答,駕駛員模擬考試2016 科目一 科目二 科目三 科目四,菌落：,單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,菌落,細菌的菌落特征因種而異,細菌的營養(yǎng)類型,根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。 自養(yǎng)菌:分類,舉例? 異養(yǎng)菌: 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌,光合自養(yǎng)型:光合細菌 化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌,放線菌,1、結構： 單細胞原核 分支狀的菌絲（基內菌絲、氣生菌絲）,鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、 氯霉素、紅霉素、慶大霉素,微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是 由放線菌產(chǎn)生的,應用:,病毒的結構,2、病毒的增殖：,真菌,一、基礎知識：,（二）培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。,（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計數(shù)等，半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運動，液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。 （2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 （3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的類型和用途,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導入了目的基因的受體細胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細胞,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：來源受限;成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結果的分析;易發(fā)生支原體污染;,根據(jù)細胞生存所需物質的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。 優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基：,血清中含有： 多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子； 激素； 促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉移蛋白 不明成分,人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔,半固體培養(yǎng)基：,無動力 有動力(彌散),(是否運動),2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 (參考教材附錄內容),3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、 無機鹽、等營養(yǎng)物質， 另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質,例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,4.培養(yǎng)基的用途,液體培養(yǎng)基：增菌 固體培養(yǎng)基：純化，增菌 半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種,二、無菌技術,1.無菌技術的概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。,（）消毒定義： 利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。區(qū)分為高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三種方式。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,（2）滅菌的定義：,以化學劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程。 滅菌消毒技術是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,1、灼燒滅菌 2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.,(2)滅菌的方法：,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。 而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。,無菌技術,3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實驗操作者的雙手,答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,三、實驗操作,1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）,1計算、稱量 2溶化 3調pH：pH76 4過濾：這一步可以省去。 5分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。 6加塞 7包扎,操作步驟,8滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。將培養(yǎng)基用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內，在160170 下滅菌2h。 9倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 10無菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。,倒平板技術,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？,問題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,2、純化大腸桿菌,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術,平板劃線的操作方法 交叉劃線法 連續(xù)劃線法,平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基的原因,一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的； 二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,問題討論,涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？,應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),菌種的保存,1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法,四、課題成果評價,（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。,本課題知識小結:,【典例解析】,例1關微生物營養(yǎng)物質的敘述中，正確的 A.是碳源的物質不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是 A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,答案：B,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關的所有設備和物質都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答： （1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是 。 （2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。 如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入 .,自養(yǎng)型微生物,含碳有機物,（3）若除去成分，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。 （4）表中營養(yǎng)成分共有 類。 （5）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要進行的是 。 （6）右表中各成分重量確定的原則是 。 （7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應該增加的成分 。,固氮微生物,3,調整pH,依微生物的生長需要確定,瓊脂（或凝固劑）,