固定化酶與固定化細胞技術(shù) 王海磊 河南師范大學生命科學學院AEM室,2. 酶在應(yīng)用中受到的限制因素：,1. 酶作為:生物催化劑的優(yōu)點,穩(wěn)定性差，易失活 反應(yīng)速度隨時間減慢（3分鐘內(nèi)吸光度的變化） 回收困難（淀粉酶水解廢棄淀粉） 經(jīng)濟上不合算：多不能重復(fù)使用。 一些酶價格昂貴（漆酶用于木板粘合）,反應(yīng)專一性強。 催化效率高（比一般催化劑高107-1013倍）。 反應(yīng)條件溫和（常溫常壓）。,（1）人工合成酶：應(yīng)用化學合成法合成具有像酶那樣活性的催化劑。這是有機合成和聚合化學中的最新技術(shù)。但距實際應(yīng)用還有很大距離。 （2）酶的人工“改性”、“修飾”：酶和細胞固定化是其中的一類。其它如基因工程、化學修飾等方法。,3. 克服上述限制性因素的途徑：,難得的報道：人工合成脂肪酶獲得成功 隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人類對環(huán)境逐步認識，酶的廣泛用途越來越得到人類的重視，尤其脂肪酶，在日化洗滌劑領(lǐng)域、醫(yī)藥美容領(lǐng)域、能源領(lǐng)域生物柴油生產(chǎn)中顯得無可替代的優(yōu)勢。一般脂肪酶生產(chǎn)主要來源于發(fā)酵微生物生產(chǎn)法獲得，產(chǎn)量受到限制，成本較高，很難滿足工業(yè)需求。關(guān)于人工合成脂肪酶在中國乃至世界未曾有過相關(guān)報道。 經(jīng)過不懈努力，我公司通過人工合成的手段獲得成功，實屬國際首例。經(jīng)檢驗它不僅具備生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、環(huán)境要求、毒化耐性各項指標遠遠高于普通生物酶。生產(chǎn)成本不足普通酶的三分之一，而且不受產(chǎn)量的局限，可大規(guī)模投入生產(chǎn)。 石家莊市華北聯(lián)化科技有限公司,第一節(jié) 固定化酶 （Immobilized Enzyme）,一、發(fā)展概況,(1) 1916，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)蔗糖酶結(jié)合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人們重視。 (2) 1950前，研究不多，不超過10篇相關(guān)論文。有目的開展固定化研究始于50年代。1953，Grubhofer和Schloith將聚氨基聚苯乙烯樹脂重氮化后與淀粉酶、蛋白酶結(jié)合最早固定化酶 (3)60年代進展較快：固定化酶投入工業(yè)化生產(chǎn)。 (4)70年代為快速發(fā)展時期。,固定化酶：連接于某種載體上或者限制在一定空間范圍內(nèi)、能連續(xù)使用的酶。,二、制備固定化酶的原則,1、保持酶原有專一性、高效催化能力和常溫常壓下起催化反應(yīng)的特點。制備盡可能在溫和條件下進行（低溫、最適pH、水溶液中）。 2、能回收、貯藏和反復(fù)使用酶和載體結(jié)合牢固性問題。 3、有一定機械強度，以利于機械化、自動化操作。 4、酶與載體結(jié)合部位應(yīng)避開活性中心及與維持酶高級結(jié)構(gòu)有關(guān)的基團。且在制備過程盡可能保護這些基團。 5、最小的空間位阻：載體盡可能地不阻礙與底物的接近。 6、穩(wěn)定性：載體不與底物、產(chǎn)物和反應(yīng)液發(fā)生化學反應(yīng)。 7、易與產(chǎn)物分離，便于回收和重復(fù)使用。 8、盡量降低成本。,三、固定化酶的制備方法,物理法: 吸附法、包埋法 化學法: 交聯(lián)法、化學共價法 綜合法: 逆膠束包囊法,（一）吸附法,采用固體吸附劑將酶吸附在它的表面使之固定的方法。,（1）無機吸附載體：礦物質(zhì)和其它無機載體。 高嶺土：胰凝乳蛋白酶 皂土： 過氧化氫酶、核糖核酸酶 氧化鋁：葡萄糖氧化酶 二氧化硅（覆蓋卵磷脂/腦磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖變位酶。 不銹鋼：直徑100-200粒子，以氧化鈦處理，可吸附-半乳糖苷酶（17mg/g載體）。,1、載體類型,9,高嶺土,性質(zhì)：良好粘結(jié)性 粒度和細度 較強結(jié)合能力 離子吸附性及交換性,瓷土，現(xiàn)在世界上都把它叫做“高嶺土”，在很久很久以前，高嶺村有一家姓盛的窮苦夫妻，日子苦得就像黃連一樣。 盛家夫妻心地卻特別善良。有一年冬天，天氣寒冷，屋檐下躺著個白發(fā)蒼蒼的老公公，盛家妻子端來了一碗熱開水，送到那老公公跟前，請他喝下暖暖身子。妻子借來米，男人生火熬粥，一會兒工夫，一大碗香噴噴，熱騰騰的米粥端到了老公公的面前。老公公見了，也不客氣，一口氣就把粥喝了下去。 我沒有什么好報答你們，我走后，可到村后東南面的松山頂上一口氣挖它個九九八十一鋤，老公公早已不見蹤影。 軟乎乎得就像糯米粉一樣：“松山頂上的石頭，可以拿來做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一樣的值錢哩！” 將挖起的土石做成一個個碗和杯的坯子來，放進窯里一燒，果然個個晶瑩潔白，真象玉器一樣。 從此，高嶺村的窮人們在盛家夫妻的帶領(lǐng)下，改行挖土建窯燒瓷器了。松山因地處高嶺，就改名叫高嶺山，山上的瓷土，就叫做高嶺土了。,10,皂土：膨潤土、火山黏土。,皂土是由天然膨潤土精制而成的無機礦物凝膠。膨潤土一般是指主 要由蒙脫土組成的一種黏土巖。皂土的主要有效成分即為蒙脫土， 含量大約90%。,蒙脫石是由兩個硅氧四面體夾一層鋁氧八面體膨潤土組成的2:1型晶體結(jié)構(gòu)，由于蒙脫石晶胞形成的層狀結(jié)構(gòu)存在某些陽離子 如Cu、Mg、Na、K等,且這些陽離子與蒙脫石晶胞的作用很不牢 固，易被其它陽離子交換，故具有較好的離子交換性 。,（2）有機吸附載體 纖維素粉：糖苷水解酶 火棉膠：木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（70mg酶蛋白/ cm2） ),（3）離子交換劑作為吸附載體 CM-纖維素、DEAE（二乙胺基乙基）-纖維素、DEAE-葡聚糖。 人工合成的陰離子、陽離子交換樹酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。 陽離子型：磺酸、磷酸、-COOH、酚基等基團 陰離子型：季胺、仲胺、伯胺基團。,火棉膠： 硝化棉溶液；硝化纖維素：用一種天然膠或合成膠增塑的樹脂與之相結(jié)合,通過溶劑蒸發(fā)而干燥后制成的材料。 對眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。經(jīng)呼吸道和消化道進入人體，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。人接觸后有咽喉痛、頭痛、嗜睡、精神遲鈍、腹痛、嘔吐、皮膚及眼結(jié)膜充血、疼痛。本品極易燃。遇明火、高熱、氧化劑或胺能引起燃燒爆炸。長期貯存能自燃。,CM-纖維素 CMcellulose 即羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose）為陽離子交換纖維素之一。,2、影響因素,pH：pH變化影響載體和酶蛋白的電荷，從而影響酶的吸附。一般在蛋白的等電點時可達最大吸附。 (2) 鹽：影響復(fù)雜。一般會阻止吸附。實際上已被用來洗脫從低鹽溶液吸附的酶。個別情況可促進蛋白的吸附于原來不吸附的惰性支持物上。 (3) 溫度：隨溫度升高而增加吸附量。但酶失活會加速 (4)載體：與載體表面積、多孔度、載體預(yù)處理有關(guān)。顆粒越小則吸附越好。多孔載體與孔的大小和表面積有關(guān)。另外載體的預(yù)處理是極為重要的：有的載體會影響酶的結(jié)合量、有的會引起酶變性、有的會降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有較高的酸性而易使酶變性，需要用緩沖液進行予處理。,3、吸附法優(yōu)缺點,(1) 優(yōu)點 操作簡單;可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體; 酶的純化和固定化可在吸附過程中一步完成;酶使用過程的失活可重新活化;載體可再生 (2)缺點 pH、溫度、離子強度、時間等多因素對固定化酶影響復(fù)雜，不同酶、不同載體的情況各不相同。 最適酶量的選擇是經(jīng)驗性的。 吸附程度和固定化酶的活力間不一定平行。 酶與載體結(jié)合力不強，易導(dǎo)致催化力喪失和污染反應(yīng)產(chǎn)物。,4、方法舉例,酶的發(fā)酵生產(chǎn) Aspergillus oryzae 3042擴大曲40-50小時發(fā)酵6倍冷蒸餾水抽提2次壓濾酶液（亮黃色）測活力。（25M/小時/ml） 載體予處理：DEAE-sephadex 25溶脹0.05mol/L NaOH處理洗滌。 固定化：酶液調(diào)節(jié)pH7.0-7.0與載體混合（載體濕重：酶液=1g：60ml）4-7冷庫攪拌吸附過夜吸去上清液用蒸餾水和0.15Mol/L醋酸鈉水溶液洗滌水洗滌后4備用。,米曲霉氨基?；?（二）共價結(jié)合法,在酶蛋白分子上功能團與固相支持物表面上的反應(yīng)基團之間形成化學共價鍵連接而使酶固定的方法。 固定化酶研究中最活躍的一大類方法,可供共價結(jié)合于載體的功能團包括： 氨基：N端-氨基、賴氨酸殘基的-氨基 羧基：C端羧基、門冬-羧基、谷氨酸-COOH 巰基：半胱氨酸-SH 羥基：酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的-OH 苯環(huán)：苯丙氨酸、酪氨酸 咪唑基：組氨酸 吲哚基：色氨酸,在進行一種酶的固定時，首先要考慮酶的氨基酸組成、活性中心的氨基酸、立體結(jié)構(gòu)及專一化學修飾對酶活性和影響。實際上，共價偶聯(lián)中最普遍使用的基團是：氨基、羧基、和苯環(huán)。 共價偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)注意的問題： (1) 共價結(jié)合的功能基團不影響酶的催化活性。 (2) 反應(yīng)盡可能溫和 (3) 最好能在水溶液中進行 (4) 較高的反應(yīng)專一性：只對某一類功能基團有很高的專一性，而對其它基團或才水溶液幾乎無副反應(yīng)。,載體選擇時的注意問題： (1) 理化性質(zhì)：應(yīng)是親水性質(zhì)的，疏水載體往往對酶有變性的作用。 (2) 有盡能大的表面積：較細顆粒、多孔載體。 (3) 機械強度和穩(wěn)定性 (4) 具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能團。,常用載體： (1) 天然高分子材料：纖維素、瓊脂糖、淀粉、葡聚糖凝膠、膠原及其衍生物。 (2)合成高聚物：尼龍、多聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等。 (3)無機支持物：多孔玻璃、金屬氧化物等。,按載體連接的基團類型分為： (1) 苯氨基載體 (2) 羧基載體 (3) 酯族氨基載體 (4) 硅烷化無機載體,載體表面獲得反應(yīng)基的反應(yīng)類型 ： 苯氨基：重氮法、異硫氰酸法 羧基：疊氮法、酰氯法、活化酯法、酸酐法 羧基、氨基：縮合法 氨基：戊二醛活化法 含羥基化合物：溴化氰法 活潑鹵素、二硫化合物、醛基高聚物：直接與酶偶聯(lián) 其它：硅烷化法、金屬鰲合法、四元縮合反應(yīng),1、重氮法,原理：帶芳氨基側(cè)鏈的聚合物用亞硝酸處理，形成重氮鹽，在中性偏堿性條件處（pH8-9），親電子的芳族重氮離子攻擊活潑的芳香環(huán)，如酪氨酸的酚基、組氨酸的咪唑基，形成相應(yīng)的偶氮衍生物。而與-NH2(N端-氨基、賴氨酸殘基的-氨基)的反應(yīng)，須在過量重氮鹽存在下形成雙偶氮化合物。,pH8-9,芳族重氮基具有疏水性，趨向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中區(qū)域。,重氮法常用的載體有： 帶苯氨基的珠狀聚丙烯酰胺 帶苯氨基的多孔玻璃 間氨基苯甲氧基纖維素 對氨基苯纖維素。,ABSE-多糖（對氨基苯磺酰乙基 )制備過程：,例：ABSE-纖維素固定化胰蛋白酶,（1）堿性纖維素制備：24g干甘蔗芒桿纖維素，加48ml 12% NaOH溶液，0攪拌1h，15倍水稀釋后過濾。 （2）活化劑配制：對-硫酸酯乙砜基苯胺24g，加60ml蒸餾水，40攪拌，加1mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5（約48ml），離心去沉淀，得到對-硫酸酯乙砜基苯胺溶液。 （3）ABSE纖維素制備：加堿性纖維素、活化劑溶液于反應(yīng)器，熱水浴保持溫度達60，立即用0.5M NaOH調(diào)節(jié)至pH13,溫度升至80,維持pH13保溫45min。以2L 0.05M NaOH洗滌3次,再以水洗滌3次。得ABSE-纖維素（約75g）,（4）偶聯(lián)酶： A. 配制酶液: 20mg胰蛋白酶溶于16ml0.05M CaCl2-0.03ml正丁胺(保護劑)混合液(預(yù)先以1M HCl調(diào)至pH9.5)； B. ABSE-纖維素處理：取5gABSE-纖維素，加10ml蒸餾水，冰水浴，邊攪拌邊加1M HCl、5%NaNO2各2.5ml，搖勻，冰浴15min抽濾，取出濾餅，迅速用預(yù)冷的0.05M HCl和蒸餾水各洗滌三次。(重氮化) C. 偶聯(lián)：濾餅投入胰蛋白酶液中，立即用2M Tris液調(diào)pH至7.5-7.8，攪拌1h，抽濾。 D. 洗滌：固定化酶以50ml 3%NaCl攪拌洗滌3次，水洗滌2次后，懸浮于0.05M CaCl2溶液中，冰箱保存?zhèn)溆谩?2、疊氮法,將載體上羧基活化成疊氮化合物，可以與酶分子上的-NH2、-OH、-SH發(fā)生共價結(jié)合。 這是最早、也是經(jīng)常使用的一種共價結(jié)合的方法。 該類方法所使用的載體有：CM-纖維素、CM-Sephadex、聚門冬氨酸、生物膠CM-100等。,反應(yīng)原理,即CM載體在酸或三氟化硼催化下以甲醇酯化，然后用水合肼肼解，再通過亞硝酸活化成疊氮化合物?？膳c酶-NH2基反應(yīng)形成肽鍵而偶聯(lián)（pH7.5-8.5，高聚疊氮化合物易結(jié)合-NH2基）。,3、溴化氰法,帶-OH基的多糖載體，通過溴化氰活化后連接酶. 具有連位-OH基的高聚物（纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）都可用此法。反應(yīng)原理：,多糖在高pH（10-11.5）用CNBr活化，在稍低pH條件下連接蛋白游離氨基。亞氨基碳酸鹽對蛋白的氨基的親核反應(yīng)十分敏感，生成N-取代異脲、N-取代亞胺碳酸酯、N-取代氨基甲酸酯的衍生物。 實際連接過程很簡單，即載體先與CNBr短時間反應(yīng)，洗去未反應(yīng)CNBr，投入酶液即發(fā)生連接。 該法優(yōu)點：1）可應(yīng)用不同的載體；2）酶連接量高；3）固定化活力高。 注意問題：CNBr有毒，稱量、溶解及活化反應(yīng)均就在通風櫥內(nèi)進行。過量試劑可在pH11條件下，用過量漂白粉處理一晚后棄去。,HCl（鹽酸）稀：比較酸，感覺嘴里滑溜溜的，典型的嘔吐物感，微辣。濃：極度的酸，吐掉以后回味苦，然后整個嘴里發(fā)涼，10分鐘后好轉(zhuǎn)。H2SO4（硫酸）?。旱乃嵛?，回味感覺油膩，微熱，甜，無任何不適感。較濃的（40%左右的）：超燙，感覺喝燙稀飯了，然后微甜感和痛感并存，持續(xù)2天才退（98%的純正濃硫酸不敢喝）。HNO3（硝酸）?。合仁强?，然后整條舌頭麻了，然后痛，起了白斑，持續(xù)疼痛，3-4天后消退，同時嘴里感覺大吸了一口汽車尾氣。濃：不敢喝 （猜測是濃硫酸的加強版）。NaOH（氫氧化鈉）?。夯旧贤瑵釴a2CO3（我嘗過，咸），多一些辣感（對蛋白質(zhì)腐蝕性強的都會有辣感 ）。濃：含在嘴里十分的辣(可能是已經(jīng)反應(yīng)起來了) 然后舌頭燒壞,呈黃色,肉腐爛，1個月不能說話,口里有赤痛感而且舌頭麻木 有辛辣感半年后出院,說話變得不準,味覺幾乎消失,嘴部留下疤痕（這東西對蛋白質(zhì)的反應(yīng)不是鬧著玩的）。CuSO4（硫酸銅）一開始沒味道，吐出后回味淡淡的苦澀（我的確嘗過）。BaCl2（氯化鋇）：極苦咸，大約相當于MgCl2的加強版CCl4（四氯化碳）這個最恐怖了，整個嘴里感到燒塑料的味道，極濃郁，吐掉以后出現(xiàn)說不出的怪異甜味，直感覺全身松軟 （的確，聞起來還可以，嘗起來就郁悶了）。Na2O2（過氧化鈉）一般的咸 （Na鹽基本都這個味道）。無水酒精嘴里完全沒味道，之后花露水的味道在鼻子里揮之不去。FeCl3）（氯化鐵）涼，然后酸，與硬幣放嘴里感覺差不多（Fe鹽都這味道）。AgNO3（硝酸銀）沒味道。稀Br2（溴）水溶液極其濃重味道，感覺像汽車尾氣與松節(jié)油混合的味（只能如此形容）Hg(NO3)2（硝酸汞）很淡的味道，有點像味精和醋混合了 。H2O2（雙氧水）特辣，趕緊吐了，之后就沒什么事情了 。還有一個百度知道里面的：極其微量的氰化物是苦的，寶貴資料啊。乙酰水楊酸我試過有點酸，有點澀，最后有點苦盡甘來的那種感覺。我嘗過溴化氫，一不小心吸進去的。味道上沒什么感覺，但是非常嗆，吸進去很少，但是咳了一整個下午，一直到吃晚飯都反胃，印象深刻啊,4、硅烷化法,無機載體機械強度好、耐受有機溶劑的作用和微生物侵蝕能力強，可以再生，在廣泛范圍的pH、壓力、溫度下載體不改變結(jié)構(gòu)，同時來源豐富、價格低廉。 無機載體支持物表面采用硅烷化反應(yīng)引入功能團，進一步可通過不同的化學反應(yīng)制成帶有苯氨基、醛基等基團成為活性載體。然后連接酶蛋白 。 載體：多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔氧化鋁、磁性氧化鐵等,1,2,3,與支持物表面硅烷醇或O-離子連接，相鄰硅烷間還可以發(fā)生聚合。其產(chǎn)物烷胺基玻璃是帶有有機功能團（氨基）的無機載體。進一步可通過不同的化學反應(yīng)制成帶有苯氨基、醛基等基團，成為活性載體。 例如，乳酸脫氫酶可通過此法偶聯(lián)與多孔玻璃。 上述方法制備的固定化酶，其穩(wěn)定性超過有機多聚物作為載體的固定化酶。,利用多功能試劑進行酶蛋白分子間的交聯(lián)，酶分子與多功能試劑間形成共價鍵，得到立體交聯(lián)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。,（三）交聯(lián)法,常用的交聯(lián)劑有： 戊二醛 雙重氮聯(lián)苯胺-2,2-二磺酸 1,5-二氟-2,4-二硝基苯 已二酰亞胺二甲酯。,戊二醛可直接參與酶蛋白分子的交聯(lián)，便其作用機理不完全清楚。實驗證明，酶蛋白分子中的賴氨酸參與了反應(yīng)?？赡苓^程如下：,多功能試劑制備固定化酶，可進一步分為： （1）單獨與酶使用。 (交聯(lián)酶法) （2）輔助蛋白、酶與之共同使用。 ( 酶輔助蛋白交聯(lián)法) （3）酶吸附載體后再進行交聯(lián)。 (吸附交聯(lián)) （4）先與載體反應(yīng)，形成多功能基團載體，然后再連接酶。(載體交聯(lián)法) 直接交聯(lián)酶法雖然操作簡便，但固定化顆粒太細，活力往往不高。,（四）包埋法,將酶包裹于凝膠格子、或聚合物半透膜微膠囊中的方法。可分為凝膠包埋法和微膠囊化法。,1、凝膠包埋法（格子型）,常用載體：海藻酸、K-角叉菜（卡拉膠）、瓊脂、三醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等。 方法：混合單體、交聯(lián)劑和酶（于緩沖溶液中進行），然后加入催化劑，系統(tǒng)開始聚合。 固定化酶成型可分為凝膠后成型、邊凝聚邊成型兩種。前者是在凝膠聚合后，將其切成小塊，再經(jīng)擠壓后形成不規(guī)則顆粒。后者是在聚合過程中使之聚合成珠狀。,卡拉膠：鹿角菜膠、角叉菜膠。是從某些紅藻類海草中提煉出來的親水性膠體，化學結(jié)構(gòu)是由半乳糖及脫水半乳糖所組成的多糖類硫酸酯的鈣、鉀、鈉、銨鹽。由于硫酸酯結(jié)合形態(tài)的不同，可分K型、I型、L型。在果凍，軟糖，冰激凌等食品工業(yè)應(yīng)用廣泛。,海藻酸：來自海藻的由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸組成的多糖?？梢种拼笫竽c道對鍶(90Sr)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等細菌亦產(chǎn)生藻酸類型的多糖 。海藻酸為淡黃色粉末；無臭；幾乎無味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氫氧化堿溶液中溶解。有助懸、增稠、乳化、粘合等作用?？捎脼槲⒛夷也模蜃鳛榘录俺赡さ牟牧?。,以聚丙烯酰胺凝膠為例加以介紹： （1）單體：丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸 （2）雙功能交聯(lián)劑：N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis) （3）催化系統(tǒng)： 堿催化系統(tǒng)：TEMED（四甲基乙二胺）和過硫酸胺系統(tǒng)；-二甲基丙腈和過硫酸鉀系統(tǒng)。 光催化：核黃素過硫酸胺系統(tǒng) 輻射、冰凍無氧輻射等。 （4）珠狀聚合包埋過程：酶、保護劑、單體、交聯(lián)劑、聚合催化劑混合后，立即在疏水相（一種乳化劑，與水有同樣密度）的有機溶劑中分散成珠狀凝膠。,舉例：制備珠狀聚丙烯酰胺包埋-半乳糖苷酶 酶液：酵母半乳糖苷酶100mg，溶于56ml磷酸緩沖液（0.05M, pH7.3）。其中含15-30%的單體、Bis 5%。 催化劑：含TEMED 0.6ml、200mg過硫酸銨的緩沖液4ml。 疏水相：1ml山梨聚糖倍半油酸與400ml甲苯-氯仿（290：110）混合. 反應(yīng)與成型：與混合后迅速加到疏水相，攪拌分散。反應(yīng)器為1L圓底燒瓶，一漿狀攪拌器，240rpm，反應(yīng)器中保持氮氣（保護物料不受氧化，保持產(chǎn)品質(zhì)量，還能保證安全） 。4聚合反應(yīng)30min 過濾、洗滌：砂芯漏斗過濾；用500ml緩沖液洗滌，再在0.1M NH4HCO3中攪拌洗滌60min。過濾,2、微膠囊化法,酶溶液被包裹在膜內(nèi)，膜既能使酶存在于類似于細胞內(nèi)的環(huán)境，又阻止了酶的脫落或直接與外環(huán)境接觸。又分為界面沉淀法和界面聚合法。,（1）界面沉淀法 某些高聚物在在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成皮膜（沉淀析出），從而將酶包裹的方法。 酶溶液在與水互不相溶的有機相中乳化，使用油溶性表面活性 劑，可形成油包水的微滴。再將溶于有機溶劑的高聚物加入攪拌著的乳化液中，然后加入一種不能溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油-水界面上沉淀、析出、形成膜，最后轉(zhuǎn)移入水相，制成固定化酶即所謂 “人工細胞”。,微囊直徑與乳化的程度有關(guān)，乳化分散的好壞又與攪拌的速度有關(guān)。 制作膜材料的高聚物： 硝酸纖維素 聚苯乙烯 聚甲酯丙烯酸甲酯等 優(yōu)點：條件溫和，不引起酶的失活。 缺點：除去膜上有機溶劑比較麻煩。,舉例：界面沉淀法制備“人工細胞” 材料：10%血紅蛋白溶液(Whatman No42濾紙過濾) 酶液：懸浮于10%血紅蛋白溶液 有機相：100ml水飽和的乙醚加1ml Span 85（水-油乳化劑），用前配制。 硝酸纖維素溶液：4%硝酸纖維素的乙醇-乙醚（1：3）溶液，蒸發(fā)至原先重量的20%，然后加乙醚至原體積，重新溶解。 苯甲酸正丁酯- Span 85溶液：1ml Span 85加于100ml苯甲酸正丁酯（用前配制）。 Tween 20：50%和1%的水溶液（去乳化和洗滌）。 磁力攪拌器、磁力攪棒、燒杯,方法： 血紅蛋白-酶液乳化：25ml酶液加等體積有機溶液，立即2600rpm磁力攪拌5秒鐘。 加成膜材料，乳化：25ml硝酸纖維素溶液，繼續(xù)磁力攪拌60秒。 微囊沉降：4放置45min。若全部沉降，去上清（約4ml），否則離心（350g，5min）去上清。 成膜：去大部分上清后，立即加苯甲酸正丁酯- Span 85溶液30ml，1200rpm攪拌30秒。4放置30min。微囊沉降完全，否則離心（350g，5min），去上清。 微囊轉(zhuǎn)移至水相：加25ml50%Tween 20，2900rpm攪拌分散30秒，減至1200rpm，同時加入25ml水，再攪拌30秒，用200ml水稀釋。離心（350g，5min），去上清。 洗滌：1%Tween 20反復(fù)洗滌，直到不再含有血紅蛋白和苯甲酸正丁酯氣味。最后懸浮于0.9%NaCl溶液中,(2)界面聚合法：,化學制微囊的方法。在油-水界面發(fā)生聚合反應(yīng)而成膜。 成膜材料：尼龍610、聚酰胺、聚脲等。 主要過程: (以尼龍膜制備為例) 酶液與聚合單體混合：酶溶于10%血紅蛋白溶液，加已甲叉二胺水溶液。 乳化：分散相為含1% Span 85的氯仿-環(huán)已烷。 聚合：加溶于有機相的癸二酰氯。 去乳化、洗滌：Tween去乳化和洗滌，轉(zhuǎn)移至水相。,表1固定化化酶制備方法及特性比較,50,四、固定化載體材料新進展,（1）傳統(tǒng)載體材料的改性 利用有機聚合物對傳統(tǒng)無機載體材料改性修飾： 右旋糖苷對硅膠表面改性修飾可改善其表面的生物親和性， 用于固定 -葡萄糖苷酶時可大大提高了酶的負載量。 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)方法，在Si(111)表面進行甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的接枝聚合則在硅表面形成刷狀 P(GMA)，并可調(diào)節(jié)P(GMA)側(cè)鏈的長度,51,上述復(fù)合載體的傳質(zhì)性能良好，側(cè)鏈富含能與酶共價連接的環(huán)氧基，故提高了固定化葡萄糖氧化酶(GOD)的載酶量，達到 0.2mg/cm2,52,無機多孔材料硅藻土在低壓下強化吸附殼聚糖，經(jīng)戊二醛活化后共價固定化青霉素?；笗r，明顯提高了酶的儲存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。 多孔且富含氨基的殼聚糖覆蓋在 SiO2 表面上并采用多種方式活化氨基時，共價偶聯(lián)胰蛋白酶的效果良好 。,53,有機高分子載體改性 甲基丙烯酸甲酯(MMA)接枝聚合到尼龍膜上，或先把苯乙烯接枝聚合到尼龍膜上再將 MMA接枝聚合到聚苯乙烯包覆層上，在膜表面引入了大量的反應(yīng)性酯基，再借助己二胺和戊二醛活化并共價固定化 -半乳糖苷酶，膜上的載酶量達到 0.5mg/cm2。 一種聚合物對另一種聚合物的表面改性修飾： Ye 等先合成聚丙烯腈-順丁烯二酸超濾中空纖維膜，用 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCHCl)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)將低分子量的殼聚糖縮合覆蓋到膜表面，形成雙層仿生膜并用戊二醛將脂肪酶偶聯(lián)到殼聚糖上，從而有效地降低了膜骨架對酶促反應(yīng)的干擾，提高了酶對酸堿和熱的耐受性。,54,55,2、新型載體材料,磁性載體：磁性載體具有特殊的磁響應(yīng)性，可以借助外部磁場從反應(yīng)體系中快速簡便地富集、分離、回收固定化酶，從而可以隨時控制酶促反應(yīng)，提高酶的使用效率。 納米級的鐵氧化物則是使用較為廣泛的一類磁性載體材料。 磁性高分子微球可以通過共聚、表面改性等化學反應(yīng)在微球表面引入多種反應(yīng)性功能基，對酶進行共價連接固定。,56,57,環(huán)境敏感性載體： 均相催化和異相分離特點的環(huán)境敏感性材料成為固定化酶的新型載體，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的溫度或 pH 實現(xiàn)了這一目的。 Kato 等用 N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酰胺(AAM)共聚合成了溫敏性凝膠載體，它具有低臨界溶解溫度(LCST)特性，即可通過升溫或降溫來調(diào)節(jié)凝膠在水中的沉淀或溶解，提高了固定化淀粉葡萄糖苷酶(AG)的催化能力。 將適當量的聚乙二醇(PEG)接枝到殼聚糖上而制得的溫敏性高分子水凝膠載體，隨著溫度的改變能在溶膠-凝膠之間轉(zhuǎn)變。 先將木瓜蛋白酶與 N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯(NAS)反應(yīng)，再利用自由基溶液聚合反應(yīng)，制備的固定化木瓜蛋白酶具有pH敏感相分離特性，兼有溶液酶和固相酶兩者的優(yōu)點,58,導(dǎo)電載體： 導(dǎo)電載體具有一定的電子傳導(dǎo)性，作為固定化酶的一類特殊載體，在基于酶電極的生物傳感器領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。導(dǎo)電載體材料主要包括兩類，導(dǎo)電高聚物載體和導(dǎo)電復(fù)合載體，前者一般是具有共軛結(jié)構(gòu)和導(dǎo)電能力的有機高聚物,如聚苯胺(PAn)、聚噻吩(PTh)、聚吡咯(PPy)及其衍生物等，后者則是在導(dǎo)電材料中復(fù)合一些特殊物質(zhì)而制得的導(dǎo)電復(fù)合載體。,59,第二節(jié) 固定化細胞,采用物理或化學的方法固定微生物細胞，是利用酶或酶系的一條捷徑。70年代迅速發(fā)展起來的一項技術(shù)。沿用了固定化酶的方法，但其應(yīng)用速度超過的固定化酶。,優(yōu)點： （1）免去破碎細胞提取酶的復(fù)雜過程。 （2）酶在細胞內(nèi)環(huán)境中，穩(wěn)定性更高，固定后酶活損失較少。 （3）可催化較復(fù)雜的反應(yīng)（復(fù)合酶系統(tǒng)）。 （4）制備成本低。,缺點： （1）多適用于胞內(nèi)酶； （2）對底物和產(chǎn)物有一定限制：要求底物、產(chǎn)物易透過細胞膜。 （3）產(chǎn)物較復(fù)雜，有副反應(yīng)，給提取增加了難度。 制備方法與固定化酶相類似，但以吸附法、包埋法應(yīng)用最多。其它方法也有嘗試，如超過濾、共價結(jié)合、交聯(lián)法等。,一、包埋法,載體：瓊脂、 明膠、 聚丙烯酰胺凝膠、 卡拉膠、 血纖維蛋白、 環(huán)氧樹脂等。,1、明膠包埋法:明膠戊二醛包埋鏈霉菌細胞 實例:葡萄異構(gòu)酶產(chǎn)生菌玫瑰暗黃鏈霉菌固定化,（1）戊二醛處理菌體細胞：10克菌體（濕重），0.1ml25%戊二醛，混勻。 （2）明膠液配制：1克明膠，加8ml水溶解。 （3）固定制膜：混合（1）和（2），鋪成2-3mm厚的膜，0-5凝固1h。 （4）戊二醛處理：0.25%戊二醛溶液75ml，浸泡24-48h。 （5）成型：機械破碎，成10目大小，蒸餾水洗滌待用。,2、聚丙烯酰胺凝膠包埋法 大腸桿菌和產(chǎn)氨短桿菌已分別用于工業(yè)化生產(chǎn)L-天冬氨酸、L-蘋果酸。,聚丙烯酰胺凝膠包埋大腸桿菌（L-天冬氨酸酶）： （1）材料準備： 菌懸液：E. coli ATCC II303，1kg菌體（濕重）加2L生理鹽水，冷至8。 單體溶液：丙烯酰胺750g，N,N甲叉雙丙烯酰胺40g，溶于2.4L水, 冷至8。,（2）固定化 混合菌懸液與單體懸液,加入催化劑:100ml25%-二甲基丙腈,500ml1%過硫酸鉀。 聚合：20-25，15-20min（聚合反應(yīng)約在5min后開始。溫度升高，當溫度升至30時，迅速用冰水冷卻）。 成型：切成3-4mm顆粒，水洗。 （3）活化細胞 固定化細胞在含有1mM Mg2+的1N反丁烯二酸銨（pH8.5）中，3724-48h。（天冬氨酸酶活力可提高9-10倍）。,3、海藻酸鹽包埋法 海藻酸為d-甘露糖醛酸和l-古羅糖醛酸通過1,4糖苷鍵聯(lián)接而成的聚合物。 （1）海藻酸鈉溶液配制：6g溶于96ml水（約6%濃度）。 （2）混合菌體：0.3g濕菌體/ml (30%W/V)。 （3）固化和成型：固化液（含Ca2+、Zn2+、Al3+等多價陽離子溶液，如0.1MCaCl2），將海藻酸鈉與菌體的混合液用針形管滴入固化液中。 （4）硬化與洗滌：顆粒放置于0.1M CaCl2浸泡1小時進一步固化。 缺點：在高濃度的電解質(zhì)（K+、Na+等）中顆粒不穩(wěn)定。 Ca2+等多價離子會在磷酸緩沖溶液沉淀，導(dǎo)致機械強度降低，和重新溶解。,二、吸附法,細胞表面帶有電荷，因此可以通過離子交換或吸附作用結(jié)合于載體。該法簡便，易于再生，但結(jié)合力弱，易脫落。工業(yè)應(yīng)用上較少。 陰離子樹脂：固定放線菌（葡萄糖異構(gòu)酶，生產(chǎn)果糖） DEAE-纖維素：固定巨大芽 孢桿菌（青霉素?；?，生產(chǎn)6-APA）。,三、其它 交聯(lián)法有少量嘗試，如含有天冬氨酸酶的大腸桿菌曾用多種雙功能試劑交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)只有戊二醛交聯(lián)能獲得有活力的制劑，但所得固定化細胞顆粒太細，機械強度差。 共價結(jié)合法：少數(shù)細菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亞胺脫水與CM-纖維素連接。細胞無生存能力，但仍保留組氨酸氨裂合酶的活性，故引起人們注意，有等進一步的發(fā)展。,第三節(jié) 固定化酶和細胞的應(yīng)用,一、在工業(yè)方面的應(yīng)用,1、氨基酸工業(yè),（1）利用固定化?；福毎┥a(chǎn)L-氨基酸 DL氨基酸拆分,工業(yè)上化學合成氨基酸都是無光學活性的DL型外消旋混合物。須將它進行光學拆分以獲得L型氨基酸。 外消旋氨基酸拆分方法:物理、化學和生物學方法，其中以酶法最有效，能夠生產(chǎn)純度較高的L-氨基酸。反應(yīng)式如下：,（2）氨基酸的轉(zhuǎn)化生產(chǎn) 門冬氨酸的生產(chǎn)：利用固定化門冬氨酸酶（細胞，E. coli）生產(chǎn) HOOCCH=CHCOOH+NH3L-門冬氨酸 反丁烯二酸 L-丙氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的生產(chǎn)：利用固定化門冬氨酸脫羧酶（細胞，惡臭假單胞菌）生產(chǎn)，其原理是， L-門冬氨酸L-丙氨酸+CO2 L-精氨酸L-瓜氨酸(冷凍固定化細胞) L-鳥氨酸（不冷凍）,（3）固定化細胞直接生產(chǎn)氨基酸 谷氨酸、組氨酸、精氨酸已通過這種方法生產(chǎn)。,2、抗生素工業(yè),（1）從青霉素生產(chǎn)青霉烷酸（6-APA）,青霉素是-內(nèi)酰胺類抗生素，都有一個共同母核6-APA。改變其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，則可改變其抗菌譜、水溶性、耐酸性、和抗-內(nèi)酰胺酶的能力。在發(fā)酵法中，對不同的側(cè)鏈前體進行發(fā)酵以生產(chǎn)不同的青霉素進行了廣泛的研究，獲得近百種，但成功的只有青霉素V，其它則因產(chǎn)率低、產(chǎn)物復(fù)雜等原因而無實用價值。,半合成是將6-APA用不同側(cè)鏈羧酸?；M一步合成了許多廣譜、耐酸、抗-內(nèi)酰胺酶、毒性低、適合不同用途的新抗生素，如氨芐青霉素、對羥芐青霉素、苯甲異惡 唑青霉素、對羥氨芐青霉素等。,獲得半合成起始物6-APA是半合成各種青霉素的關(guān)鍵。發(fā)酵法生產(chǎn)6-APA產(chǎn)量低，分離困難。故直接發(fā)酵法被排除。50年代酶催化水解青霉素生產(chǎn)6-APA成功。已工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。使用酶法生產(chǎn)6-APA產(chǎn)率很低。固定化細胞（酶）可提高6-APA的產(chǎn)率（100-500倍）。反應(yīng)原理是：,（2）固定化法生產(chǎn)7ACA(7-氨基頭孢霉烷酸)和7-ADCA(7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢霉烷酸),發(fā)酵法生產(chǎn)的主要產(chǎn)物是頭孢霉素C，其母核是7-ACA。7-ACA是制備半合成抗生素頭孢噻吩、頭孢唑啉的起始化合物。 可由頭孢霉素C經(jīng)Ps. pudita(惡臭假單胞菌)產(chǎn)生的?；杆馍?-ACA。 也有兩步法的研究：頭孢霉素CTrigonopsis variabilis生物轉(zhuǎn)化為谷氨酰-7ACA再由Ps. sp 或Comamonas sp.水解為7ACA。,（3）催化合成新的青霉素和頭孢霉素 6APA（7ADCA）+側(cè)鏈衍生物固定化酰化酶（細胞）新的青霉素或頭孢霉素。 但由于底物、產(chǎn)物抑制作用、反應(yīng)的可逆性，反應(yīng)產(chǎn)率低，與化學合成法相比優(yōu)越性不突出。個別產(chǎn)率較高的值得進一步探索。 （4）固定化直接發(fā)酵生產(chǎn)抗生素 青霉素、桿菌肽。,3、糖和醇類的生產(chǎn) 果葡糖漿的生產(chǎn) 山梨糖山梨醇 乙醇、異丙醇、正丁醇等。 4、其它 有機酸：反丁烯二酸L-蘋果酸。萘水楊酸等 甾體轉(zhuǎn)化：氫化可的松氫化波尼松 生產(chǎn)核酸、核苷酸、輔酶等,二、在生化分析上的應(yīng)用 酶電極、微生物傳感器（如致癌物的篩選等）,