實(shí)驗(yàn)六 聚丙烯酰胺凝膠柱狀電泳分離血清蛋白質(zhì),指導(dǎo)教師 劉建昌、池雪林,一、目的,1、掌握聚丙烯酰胺凝膠柱狀電泳的原理、操作方法。 2、學(xué)會(huì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。,二、原理,“不連續(xù)系統(tǒng)”最大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率，這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng)；（2）配制 兩種凝膠的緩沖溶液成分及PH值不同；（3）配膠緩沖液與電泳槽中電泳緩沖液的成分、PH值也不相同。在實(shí)驗(yàn)中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠，成膠的緩沖液是Tris-HCL，PH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠，成膠的緩沖液是Tris-HCL,PH8.9。電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，PH8.3?？梢姡z濃度、成膠成分、PH值與電泳緩沖液系統(tǒng)各不相同，形成了一個(gè)不連續(xù)系統(tǒng)。,在不連續(xù)系統(tǒng)中電泳時(shí)，甘氨酸、蛋白質(zhì)、鹽酸中的氯離子和溴酚藍(lán)等均解離為陰離子，形成離子流向陽極泳動(dòng)。當(dāng)電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子進(jìn)入濃縮膠時(shí)，pH值降到接近于甘氨酸等電點(diǎn)（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷明顯減少，遷移率減慢。樣品中蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠，pH值的改變雖對其解離度有影響，但比對甘氨酸小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質(zhì)分子不會(huì)造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中Cl離子則全部解離，其遷移率最快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸蛋白質(zhì)溴酚藍(lán)Cl離子的順序。,甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降，造成移動(dòng)離子流的突然缺失，出現(xiàn)電流減少電導(dǎo)率下降，然而整個(gè)電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變，根據(jù)電導(dǎo)及電位梯度成反比，于是在前導(dǎo)離子Cl與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個(gè)局部高電位梯度區(qū)域中的血漿蛋白質(zhì)各成分，在高電場作用下迅速以不同的速度泳向前導(dǎo)Cl離子區(qū)域。當(dāng)?shù)竭_(dá)前導(dǎo)Cl離子區(qū)域時(shí)因不缺少離子，大的電場強(qiáng)度減弱，離子移動(dòng)速度急速減慢下來，結(jié)果在甘氨酸和Cl離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小濃縮成層。蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。,當(dāng)離子流繼續(xù)向前，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時(shí)，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時(shí)在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現(xiàn)象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復(fù)具有恒定的電場強(qiáng)度，蛋白質(zhì)的分離完全按一般區(qū)帶電泳方式進(jìn)行。 不連續(xù)電泳最主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠。蛋白質(zhì)各成分預(yù)先分開且壓縮成層，可以減少在電泳時(shí)由于自由擴(kuò)散而造成的區(qū)帶相互重疊，這樣就是提高了電泳的分辨能力。,三、試劑及器材,（1）制備兩種膠的貯存液：見操作。 （2）電極緩沖溶液 取甘氨酸28.8g及Tris6g分別溶解后，加蒸餾水到1000ml，為pH8.5。用前稀釋10倍。 （3）染色液：0.25g考馬氏亮藍(lán)R250,加入454ml甲醇水溶液和46ml冰醋酸。 （4）脫色液：75ml冰醋酸、875ml蒸餾水與50ml甲醇混合。 （5）凝膠電泳玻管：選內(nèi)徑56mm、外徑78mm、長80100mm光滑均勻的玻璃管。 （6）510ml注射器 （7）10cm長注射器針頭（7號） （8）100l微量取樣器。 （9）圓盤電泳槽 （10）0.05%溴酚藍(lán),四、操作,1、凝膠柱的制備 將洗凈烘干的玻璃管一端插入疫苗瓶的橡皮帽中，或用其他材料將玻璃管一端封閉。將封閉的一端朝底垂直放于桌面支架上。 按表6-1先配制分離膠，在50ml干燥小燒杯中按比例加入1、2號溶液及蒸餾水，放入干燥器中，用水泵或抽氣機(jī)抽氣至溶液中無氣泡冒出為止。取出，加入新配制的過硫酸銨，用玻璃棒混勻，及時(shí)用皮頭滴管吸取膠液灌入玻璃管內(nèi)約6.5cm高。然后立即順管壁加入510mm高的水層，以隔離空氣加速凝膠的過程。待30min既凝聚成膠，此時(shí)膠與水之間形成一條明顯的界線。倒出膠面上的水，也可用濾紙條吸干。,按表6-1配制濃縮膠，在抽氣后加入核黃素，混勻。先用部分膠液沖洗分離膠面，倒出，在立即灌入余下的濃縮膠約1cm高，再沿管壁加入緩緩加入蒸餾水約0.5cm高度，放置約30分鐘左右。此時(shí)可見濃縮膠呈一層明顯的灰白色膠柱。除去水層，用電極緩沖液洗滌膠面，吸棄，再用電極緩沖液加滿至管頂，即可上樣電泳。,2加樣 取新鮮血清（動(dòng)物或人）5l，加40%蔗糖5l和溴酚藍(lán)5l，放置在干凈的白瓷板孔中，混勻。用微量取樣器吸取樣品，讓針頭穿過膠面上的緩沖液，緩慢推動(dòng)取樣器，使樣品慢慢落在膠面上。推動(dòng)取樣器時(shí)不宜過猛，以免樣品和緩沖液混合。,3電泳 將已加好樣品的凝膠管，輕輕除去下端的皮塞或封閉物，將管插入圓盤電泳槽孔中，管要插得垂直。插好后加入少量電極緩沖液于槽中，檢查是否漏水。如不漏水即可加足電極緩沖液，至少要淹沒過凝膠管頂部。電泳槽下槽中也加入電極緩沖液，至少要淹沒電極。然后接通電源，負(fù)極在上，正極在下。電泳初期電壓控制在80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，加大電壓到160V，繼續(xù)電泳。當(dāng)指示劑到達(dá)距管底1cm處時(shí)停止電泳，關(guān)閉電源。,4、剝膠 倒出電極緩沖液，取出凝膠玻璃管。用帶長注射針頭（10cm）的注射器吸滿水，針頭插入玻璃管壁與凝膠之間，邊插入邊推水，并使針頭沿管壁轉(zhuǎn)動(dòng)，直到針頭插到頭。這樣凝膠柱即可脫離玻璃管滑出。若仍不自動(dòng)滑出，可用洗耳球輕輕把凝膠柱吹出。但不能用力過大，以免凝膠滑出過猛而斷裂。,5染色 將取出的凝膠柱放入大試管或平皿中，加入染色液，染色2030min。倒處染色液并回收，換成脫色液漂洗，多次更換脫色液或放在37處加熱促進(jìn)脫色，直至無蛋白區(qū)帶處背景的顏色腿凈，可見清晰的血清蛋白質(zhì)電泳圖譜為止。 電泳結(jié)果可用掃描儀掃描記錄或拍照。凝膠柱在7%的醋酸溶液中可長期保存。,