,血清蛋白的分離- 聚丙烯酰胺凝膠電泳法,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 2) 掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù),二. 基本原理,(一) 電泳 電泳: 帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下,向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.,(二) 聚丙烯酰胺凝膠電泳,用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質(zhì).以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱PAGE)。,1. 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性,(1) 凝膠有彈性，機(jī)械性能好；幾乎無吸附和電滲作用，樣品分離重復(fù)性好； (2)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度較高。 (3)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑； (4)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,2. 凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān),3 凝膠聚合催化體系,（1）光催化：核黃素,（2）化學(xué)催化：AP-TEMED 催化體系,Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響： 催化劑和加速劑的濃度 pH 堿性條件 溫度 分子氧 雜質(zhì),4.聚丙烯酰胺凝膠種類 (1) 連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類,不連續(xù)系統(tǒng):是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。,(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠,濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH 6.7的Tris-HC1。 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH 8.9 Tris-HC1。 電極緩沖液是pH 8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。,1) 樣品濃縮效應(yīng) A. 凝膠孔徑不連續(xù)性 B. 緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 C. 電位梯度的不連續(xù)性 2) 分子篩效應(yīng) 3) 電荷效應(yīng),(3) 不連續(xù)體系凝膠對(duì)蛋白的分離作用,三. 實(shí)驗(yàn)器材,1、電泳儀,電泳槽及其附件 2、培養(yǎng)皿 3、搖床 4、燒杯 5、移液管 6、微量進(jìn)樣器 7、針管,電 泳 裝 置,電泳儀： 提供直流電在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移,垂直平板電泳槽,每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。,四. 實(shí)驗(yàn)試劑,人血清； 分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液 PH8.9； 濃縮膠緩沖液: Tris-HCl緩沖液 PH6.7； 分離膠貯液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,無離子水溶解定容至100ml； 濃縮膠貯液: Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml； 過硫酸銨溶液（AP） 電泳緩沖液: Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3； 固定染色液 脫色液,(一) 垂直平板電泳槽的安裝 (二) 凝膠的制備 (三) 加樣 (四) 電泳 (五) 固定和染色 (六) 脫色,五. 操作步驟,五. 操作步驟,(一). 垂直平板電泳槽的安裝,注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。,要將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。,(二). 凝膠的制備,1 分離膠的制備 (7%) 配8 mL (按如下順序加入）,分離膠緩沖液 1 mL 分離膠貯液 2 mL 去離子水 4 mL TEMED 2 uL 過硫酸胺（AP) 1 mL,將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至2/3處，再取大約3 mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。,加入此物后請(qǐng)迅速混勻加樣，否則易凝固無法加樣,凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.,水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡,2.凝聚后倒出上層的高純水，可用濾紙?jiān)谶吘壩?3.濃縮膠的制備 (2.5%) 配 4 mL(按如下順序加入）,濃縮膠緩沖液 0.5 mL 濃縮膠貯液 1 mL 去離子水 2 mL 過硫酸胺（AP) 0.5 mL,迅速混勻,用膠頭滴管沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面,直至上邊緣, 迅速插入加樣梳, 室溫靜置一段時(shí)間. 加樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面貼長(zhǎng)玻板.,凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳，用窄條濾紙吸在玻板邊緣吸去多余的液體。,(三). 進(jìn) 樣,除去底板，將制膠裝置放在電泳槽內(nèi)， 加入稀釋10倍的Tris甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內(nèi)槽加入，上面沒過短玻璃板，外槽液面沒過最下一個(gè)螺絲處, 加樣前要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果.（用針筒將凹洞中的氣泡抽出）,用微量進(jìn)樣器取已經(jīng)混合好的樣品 15l ，在距凝膠凹形槽底三分之一處緩緩進(jìn)樣, 每人加2個(gè)樣，兩邊各留2 孔不加樣，避免邊緣效應(yīng)。 加樣時(shí)不可過低,以防刺破膠體,(三). 進(jìn) 樣,(四). 電 泳,將電泳儀的正極負(fù)極與電泳槽連接（方向切勿接錯(cuò)），打開電泳儀開關(guān)，開始時(shí)將電壓調(diào)至150V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至250V。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離凝膠下端2cm時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。,電泳結(jié)束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂）在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，用緩沖液沖洗膠板，將其移至大培養(yǎng)皿中染色。 剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損,染色要充分.,(五). 固定和染色,將凝膠放入固定染色液中，使染色液剛好沒過膠板，放到搖床上，緩慢搖動(dòng)，染色7 min。(注意染色液要用漏斗回收）,(六). 脫 色,放置搖床上，用脫色液漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。,六. 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果,可在培養(yǎng)皿下襯一白紙，便于觀察，用手機(jī)拍下凝膠圖，打印出來附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告后。,1、Acr和Bis為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，操作應(yīng)戴手套。 2、玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與 玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時(shí)凝膠板易斷 裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格的清洗。 3、安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng)、短玻璃板的硅橡膠框時(shí)，位置要端正， 均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏，但亦不可太用力 旋，易將玻板邊緣壓破。 4、制備濃縮膠時(shí)，注意梳齒邊緣不能有氣泡,膠凝聚后，注意拔梳 子要垂直小心拔出。 5、電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方 向泳動(dòng)。,注 意 事 項(xiàng),Thank you for your attention,