血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE),pp61,掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)的原理；熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法和操作技術(shù)。,目的與要求：,制備凝膠 安裝凝膠管 加樣（血清樣品15-20L、其中含甘油、溴酚蘭） 電泳（3mA/管） 剝膠 染色和脫色,操作步驟,實(shí)驗(yàn)原理： 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成，具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物在垂直的玻璃管中進(jìn)行電泳，電泳分離的區(qū)帶類似圓盤狀故命名為圓盤電泳。,結(jié)果,聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳兩類 連續(xù)電泳指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液，pH值和凝膠網(wǎng)孔的孔徑都是相同的。 不連續(xù)電泳是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑。,具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。,不連續(xù)圓盤電泳的凝膠管中置有兩種不同的凝膠層：濃縮膠、分離膠。,不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力,濃縮膠的濃縮效應(yīng),電極緩沖液：Tris-Gly 溶液（pH 8.3） 濃縮膠緩沖液： Tris-Cl 溶液（pH 6.7） 分離膠緩沖液： Tris-Cl 溶液（pH 8.9） 溶液中主要的負(fù)離子： pI : 血清蛋白質(zhì)（5.0左右）< 甘氨酸（5.97） 以及完全解離的Cl離子 形成先導(dǎo)離子（快離子）、尾隨離子（慢離子）,P26,在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7時(shí)很少解離，其有效泳動(dòng)速率很低，而氯離子卻有很高的泳動(dòng)速率，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率介于兩者之間。加上電壓以后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性和電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動(dòng)，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)速率乘積相等的穩(wěn)定態(tài)，使這些帶電顆粒以相同的速度泳動(dòng)，兩種離子之間有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)，在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動(dòng)速率比甘氨酸快。因此，移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對蛋白樣品沒有分子篩作用。當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí)，凝膠的pH明顯增加，導(dǎo)致甘氨酸大量解離。此時(shí)，甘氨酸的有效泳動(dòng)速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動(dòng)。由于凝膠孔徑變小，蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯度和pH環(huán)境中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進(jìn)行分離。 可見，甘氨酸并非作為緩沖成分參與，而是作為尾隨離子來參與電泳過程。,制備凝膠 安裝凝膠管 加樣（血清樣品15-20L、其中含甘油、溴酚蘭） 電泳（3mA/管） 剝膠 染色和脫色,操作步驟,制備凝膠,分離膠,濃縮膠（過硫酸銨后加）,1%AP：過硫酸銨（引發(fā)劑） 1%TEMED：四甲基乙二胺（催化劑） 引發(fā)劑在凝膠形成中提供自由基，通過自由基的傳遞， 使丙烯酰胺成為自由基，導(dǎo)致聚合反應(yīng)。 催化劑則可加快引發(fā)劑產(chǎn)生自由基的速度。,注意事項(xiàng)： 丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，避免呼吸道吸入和皮膚接觸。 電泳注意用電安全。,制備凝膠 安裝凝膠管 加樣（血清樣品15-20L、其中含甘油、溴酚蘭） 電泳（3mA/管） 剝膠 染色和脫色,操作步驟,