地高辛標(biāo)記寡核苷酸，熒光標(biāo)記二抗，ISH，冰凍切片操作過(guò)程：1、 多甲固定：應(yīng)盡量在半個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。（固定時(shí)間以24-36小時(shí)為宜，避免RNA降解或固定過(guò)度。）2、 切片:為獲得高雜交信號(hào)，冰凍切片應(yīng)切成10um-20um。（選用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出來(lái)以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢復(fù)室溫。（重新固定10-15min）3、 用0.1MPB洗切片3*5min4、 切片放入100%乙醇5min，空氣中干燥。雜交液：（20ml） 藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去離子甲酰胺 10ml將他們?nèi)芙夂螅尤胍韵挛镔|(zhì)：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后長(zhǎng)期貯藏與-20度中，用前預(yù)熱到37度。雜交溶液：將地高辛加入雜交液中，探針的濃度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml為起點(diǎn)來(lái)摸索條件），所加的雜交液的體積看切片的大小來(lái)決定，對(duì)于2cm*2cm的組織，一般是加50ul，但是對(duì)于嗅球，可能30-40ul足夠。加好雜交液以后，用蓋玻片蓋上切片（注意中間不要留有任何的氣泡），為防止雜交液從蓋玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的話雜交會(huì)有一個(gè)很高的背景）在濕盒中37度雜交18小時(shí)，這個(gè)雜交時(shí)間可以延長(zhǎng)到40小時(shí)來(lái)提高雜交的信號(hào)，但是前提是不能讓切片干燥。雜交后處理;制備0.5*SSC和1*SSC（從20*來(lái)稀釋）并且保證這兩種SSC在使用的時(shí)候的溫度是55度。注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（將1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）雜交后，用小鑷子將蓋玻片輕輕移走，然后倒掉雜交液，將切片放入洗液中，在振搖水浴 中按照下面的要求來(lái)洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室溫2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室溫將切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。檢測(cè)：將切片轉(zhuǎn)移到TBS緩沖液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），將切片在TBS緩沖液中洗3*5min，封閉：（可選）將切片放在封閉液中放置30min（封閉液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常綿羊血清（sigma）或者是1%的其它合適的封閉劑（Roche）,將切片拿出封閉液中，用地高辛抗體和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常綿羊血清（sigma）或者是1%的其它合適的封閉劑（Roche）于室溫下孵育至少4小時(shí)，然后在TBS中洗3*5min ，然后在去離子水洗滌幾次以去除鹽，最后用抗淬滅劑分片觀察原位雜交要做的對(duì)照;1、 切片中mRNA的質(zhì)量（前提是新鮮的組織樣品）和protocol的有效性。 PolyT探針：如果PolyT探針雜交的信號(hào)很弱的話，說(shuō)明切片的RNA已經(jīng)降解比較嚴(yán)重。2、 雜交特異性對(duì)照：檢測(cè)探針只是和RNA結(jié)合，用RNA酶處理后如果沒(méi)有雜交信號(hào)的，則說(shuō)明雜交只是和RNA結(jié)合。（注意，RNA酶的處理應(yīng)該在固定以后用PBS洗兩次*5min立即進(jìn)行） 用正義和反義探針來(lái)雜交，如果用正義探針雜交得不到任何的信號(hào)，則可以說(shuō)明雜交的信號(hào)是特異性的雜交預(yù)處理：1、 在37 恒溫箱內(nèi)干燥切片后，滴加 5-10g/ml蛋白酶K，置37 濕盒內(nèi)孵育30min， 475 酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。一般應(yīng)用蛋白酶K 1g/ml(于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0緩沖液中)，37孵育1520 min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以終止蛋白酶K的消化作用，應(yīng)用胃蛋白酶(Pepsin)20100 g/ml(用0.1 N HCl配)37、30 min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。2、0.25% 醋酸酐10min, 經(jīng)70 2×SSC漂洗、40 2×SSC各漂洗15min，2×SSC 3min，切片經(jīng)75-100% 酒精梯度脫水。1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探針的可結(jié)合性。蛋白酶K 濃度過(guò)低，不能使靶核酸有效暴露，濃度過(guò)高則組織消化過(guò)度，也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。蛋白酶K須用蛋白酶K緩沖液配制(0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0，50mmol/L EDTA，經(jīng)高壓滅菌后備用)，蛋白酶K應(yīng)新鮮配制，低溫冰箱內(nèi)分裝保存。蛋白酶K消化組織切片是原位雜交實(shí)驗(yàn)流程中重要環(huán)節(jié)，蛋白酶K濃度應(yīng)力求準(zhǔn)確無(wú)誤。2. 根據(jù)組織類型、固定液的種類，固定時(shí)間和切片的厚薄的不同，蛋白酶K濃度也存在差異，選用蛋白酶K最佳消化濃度是原位雜交成功的必要條件，不可省略預(yù)雜交預(yù)雜交液;臨用前加；預(yù)雜交液不加配制：先以去離子甲酰胺與SSC于室溫混合，加入硫酸葡聚糖于50促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室溫常需數(shù)小時(shí)才能完全溶解。有時(shí)需旋渦振蕩。定容后充分混合。根據(jù)使用方便可分裝（最好用鋁箔將瓶子包好）存于4，可達(dá)數(shù)月。注意，雜交緩沖液在使用前切忌污染1、 將DEPC處理的切片經(jīng)ddH2O漂洗 2×5min2、 按組織片大小， 每張切片滴加40l雜交液，置37 溫盒內(nèi)2小時(shí)雜交1、 抖去甩干雜交溶液，用DAKO魔筆沿組織周圍劃圈，滴加30l 探針雜交液/每張切片(內(nèi)含20ng地高辛標(biāo)記的探針)，在某溫度下（改溫度為：TM- ）濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜雜交液內(nèi)加入變性剪切的鮭魚精子DNA在雜交前加入，與其它雜交液分開儲(chǔ)存。雜交液能在20保存幾個(gè)月雜交后處理1、將切片置37 2×SSC中漂洗2×10min。 2. 在37 2×SSC 漂洗2×15min、1×SSC 漂洗2×15min、0.25×SSC 漂洗2×15min，均需用振蕩漂洗切片。最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturationtemperature, TOR）：Tor =Tm 25苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm (10 或15)非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm (30 或35)在2×SSC 反應(yīng)液中，可以根據(jù)下列公式計(jì)算最適復(fù)性溫度：TOr =0.51 (G+C%)+47減低背景染色背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后(Posthybridization)的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對(duì)RNA除去。一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是漂洗的過(guò)程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。4雜交后漂洗(1)2×SSC液內(nèi)振動(dòng)移除蓋片。(2)2×SSC 55 10 min×2。(3)05×SSC 50 5 min×2。(4)緩沖液(含05%封阻試劑，用緩沖液溶解)37 30 min。(5)緩沖液(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室溫。(6)酶標(biāo)地高辛抗體(15 000，應(yīng)用緩沖液解釋)37 30 min。(7)緩沖液 15 min×2，室溫。(8)緩沖液(100 mmol/L TrisHCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室溫，2 min。(2)雜交后漂洗其目的是去除未參與雜交體形成的過(guò)剩探針,消除與組織或細(xì)胞之間的非特異性結(jié)合的探針,降低背景染色,增加信/噪比。將雜交玻片從濕盒(或雜交儀)中取出,用2×SSC將蓋玻片洗脫,2×SSC 30洗2次,每次15 min;1×SSC 42洗2次,每次15 min;05×SSC 37洗2次,每次15 min,TBS緩沖液洗2次。注意在漂洗過(guò)程中切不要使切片干燥。(5)對(duì)照試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照:用已知含靶核酸序列的組織作對(duì)照。陰性對(duì)照:用已知不含待測(cè)靶核酸序列的組織作對(duì)照。用免疫組化檢測(cè)方法來(lái)確定雜交信號(hào)的分布。省略標(biāo)記探針。DNA酶消化靶DNA對(duì)照。HJ1(6)非特異性染色非特異性染色可能會(huì)來(lái)自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細(xì)胞、顯色系統(tǒng)等;探針特異性不高以及組織細(xì)胞內(nèi)某些成分與顯示系統(tǒng)中的抗體成分非特異結(jié)合也可造成非特異性染色。組織細(xì)胞內(nèi)源性酶是原位雜交中非特異性著色的重要原因,目前最常用的酶是過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細(xì)胞中,因此用這些酶時(shí)應(yīng)有消除內(nèi)源性酶的相應(yīng)步驟。如過(guò)氧化物酶用3% H2O2處理510 min;10%冰醋酸處理組切片10 min,或在底物顯色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止內(nèi)源性堿性磷酸酶的染色。NBT/BCIP顯示堿性磷酸酶時(shí)如果在光照下顯色也會(huì)增強(qiáng)非特異性染色。必須根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)不同的標(biāo)記酶作不同的內(nèi)源酶處理。2. 探針的長(zhǎng)度原位雜交反應(yīng)中探針濃度應(yīng)超過(guò)靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大信噪比，因?yàn)楸尘爸雀叩团c探針濃度有關(guān)。最佳探針濃度是最低探針濃度達(dá)到靶核酸的最大飽和結(jié)合度為目的。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為0.5ng/l，而非放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度1.0ng/l 。雜交液的量要適當(dāng)，每張切片以30-50l為宜。保持雜交液不流失的關(guān)鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應(yīng)用雜交罩等也很必要。3.雜交的溫度和時(shí)間設(shè)置和調(diào)整雜交溫度是RNA原位雜交的重要環(huán)節(jié)。雜交溫度應(yīng)低于解鏈或融解溫度(melting temperature Tm)20-30。多數(shù)RNA原位雜交Tm為95，由于這一溫度對(duì)保存組織形態(tài)完整和組織切片的粘附將產(chǎn)生不利影響，為此在雜交液中常以增加甲酰胺濃度來(lái)降低Tm值，因?yàn)槊吭黾? 甲酰胺濃度可降低0.72。另外雜交體中GC的百分比，雜交體長(zhǎng)度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關(guān)。雜交反應(yīng)的時(shí)間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時(shí)間過(guò)短會(huì)造成雜交不完全，雜交時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加非特異性著色。一般RNA原位雜交采用雜交孵育過(guò)夜，在黑暗環(huán)境下進(jìn)行，可以避免光線對(duì)甲酰胺的電離作用。為利于mRNA檢測(cè)，固定時(shí)間不要超過(guò)36小時(shí)，以免引起RNA與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)。(三)預(yù)雜交(1)切片用DEPC處理的PBS PH7.4(140mmol/L NaCl ，2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HPO4, 1.8mmol/L KH2PO4) 孵育2×5min，再用DEPC處理的含100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片2×5min。(2)用DEPC處理的含0.3% Triton X-100 PBS孵育15min。(3)用DEPC處理的PBS漂洗2×5min。(4)冰凍切片用TE緩沖液（100mmol/L Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH 8.0）不含RNA酶的1g/ml蛋白酶K，在37 下通透切片30 min。石蠟切片用TE緩沖液配制的不含RNA酶的5-20g/ml蛋白酶K，在37 下通透切片30min。(5)在4 下用DEPC處理的4 多聚甲醛PBS 溶液作后固定5min。(6)再用DEPC 處理的PBS沖洗切片2×5min。(7)切片作酸酐處理，處理液含0.25醋酸酐、0.1mol/L 三乙醇胺(Triethanolamine TEA)PH8.0，振蕩漂洗2×5min。(8)在37 孵育切片后，雜交緩沖液沖洗（含50 去離子甲酰胺的4×SSC），至少10 min。注意事項(xiàng)(1)切片的通透化是RNA原位雜交關(guān)鍵步驟，特別對(duì)回顧性資料尤為重要，因固定液種類和固定時(shí)間的不同，需作最佳通透化條件探索，包括蛋白酶K濃度，孵育時(shí)間20-30min之間調(diào)整，甚至采用0.2mol/L HCL配制的0.1 胃蛋白酶。(2)由于醋酸酐極不穩(wěn)定，宜將醋酸酐在使用前加到TEA緩沖液中。(3)1×SSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2。(四)免疫熒光檢測(cè)1. 滴加封閉緩沖液(100mmol/L Tris-HCl PH7.5、150mmol/L NaCl、2% BSA) 置37 濕盒內(nèi)30min，以封閉非特異性結(jié)合部位。2. 瀝干細(xì)胞片，滴加抗地高辛抗體(1:200、1:500用封閉緩沖液配制) 在37 內(nèi)45 min。3. 用Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.05% Tween 20) 沖洗漂洗各5min。4. 由低濃度至高濃度(70%，90%，100%)各級(jí)酒精梯度脫水各5min。5. 空氣中干燥細(xì)胞片。6. 滴加甘油顯色混合液。注意事項(xiàng)甘油顯色混合液的配制：9份甘油比1份(1mol/L Tris-HCl(PH7.5)， 2% 1.4-diaza-bicyclo-2.2.2-octane (DABCO)和DNA復(fù)染劑(或碘化丙啶Propidium iodide PI 500ng/ml)或 DAPI (75ng/ml)7. 在熒光顯微鏡下觀察。3 預(yù)雜交和雜交(1)加約30 l預(yù)雜交液在每張載片上,室溫孵育1 h。如加鯡魚精子DNA,用前須在沸水浴中加熱變性10 min,酵母tRNA不用加熱。(2)預(yù)雜交后以2×SSC漂洗,以吸水紙?jiān)嚫汕衅車?應(yīng)用預(yù)雜交液稀釋地高辛標(biāo)記的Oligo探針,濃度根據(jù)于待測(cè)核苷酸含量和實(shí)踐的結(jié)果。如對(duì)于檢測(cè)大鼠垂體的前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo探針,其理想工作濃度為342 ng/ml(0 342 ng/l)。(3)加30 l雜交液在切片上,加硅化蓋玻片,在37過(guò)夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42。(4)次日室溫2×SSC液漂洗切片1 h。(5)1×SSC漂洗切片1 h(室溫)。(6)05×SSC 37漂洗半小時(shí)。(7)05×SSC室溫漂洗半小時(shí)。(8)顯示等方法同前述。Application Dilution Conc. g/ _lSufficient for.in situ hybridization1:5001:1000 0:20:42Denhardts液通常配成10×，50×或100×的儲(chǔ)備液配制：稱取上述試劑，溶于800ml左右滅菌ddH2O中，定容至1000ml后，過(guò)濾后于-20保存?zhèn)溆?。該液用于配制雜交液及予雜交液等。1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于雜交前標(biāo)本處理，其作用是使組織達(dá)到一定消化，利于檢測(cè)分子的穿透，從而提高檢測(cè)方法的敏感性，但各種組織在不同條件下消化程度不一，因此，具體應(yīng)用時(shí)，應(yīng)根據(jù)組織種類、溫度確定反應(yīng)時(shí)間及酶的濃度。過(guò)度消化可使組織形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，核酸分子也會(huì)受到影響。通常是將其配成儲(chǔ)備液（1mg/ml），臨用前，再配成工作液（約0.025mg/ml）。配制方法：精心稱藥，將二者充分混合后，分裝成小份，-20存放，用時(shí)再取出凍融，余者棄去。（2）工作液（臨用前配）：取儲(chǔ)備液（1mg/ml）按1：40稀釋，充分混合，即得約含Pro.K為25mg/ml的工作液。（3）關(guān)于P-K緩沖液的配制：稱取上述試劑，充分混合即可。1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：先將Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl將pH調(diào)至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高壓滅菌，室溫備用即可。0.5mol/L的EDTA：稱取EDTA溶于約600ml ddH2O中，常需60持續(xù)攪拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0時(shí)，EDTA才開始溶解。待完全溶解后，冷卻至室溫，NaOH調(diào)pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高壓滅菌，室溫備用。2甘氨酸（1）1mol/L甘氨酸：稱取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后補(bǔ)足ddH2O定容至1000ml，高壓滅菌備用。該液為儲(chǔ)備液，-20儲(chǔ)存。（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：將二者按1：10比例稀釋，即得甘氨酸工作液。一般要求臨用前新鮮配制。甘氨酸有終止蛋白酶K作用的作用，以防過(guò)度消化。30.25%醋酸-0.25%醋酸酐配制：按上述配方，先以少許DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及濃HCl。DEPC水定容至約1000ml(997.5ml)，臨用前，一邊搖動(dòng)溶液一邊加入醋酸酐，充分混合。注意操作時(shí)避免濃HCl 濺出，最好在通風(fēng)條件下進(jìn)行。生物體內(nèi)有些組織，如神經(jīng)組織中的蛋白質(zhì)，對(duì)帶負(fù)電荷的核酸探針較易吸附。經(jīng)該液乙?；幚砗?，可使切片標(biāo)本表現(xiàn)帶上負(fù)電荷，有排斥帶負(fù)電的核酸探針，減少非特異吸附，降低反應(yīng)背景的作用。4RNA酶溶液取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分裝成小份（1ml,10mg/ml），-20儲(chǔ)存。臨用前，取RNA酶A儲(chǔ)備液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.5.0.2%取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振蕩使其充分混合。八、雜交后漂洗溶液無(wú)論用何種標(biāo)記方法及何種信號(hào)顯示方法，在雜交后洗脫則是大同小異。在此，歸納幾種帶有共同性及常用的洗脫液。該液常用于雜交后的初次洗脫，故離子強(qiáng)度（張力）較高。該液常用于雜交后的第二次洗脫，離子強(qiáng)度較低，經(jīng)過(guò)上述兩套洗脫液洗后，有的還可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脫。主要是洗去殘留的RNA，降低背景。用于以RNA為探針的原位雜交方法中。4Dig標(biāo)記探針雜交后處理液用ddH2O溶液并定容至1000ml。用ddH2O溶解并定容至1000ml。配制同上。