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1、課題 1.2基因工程的基本操作程序 學習目標:簡述基因工程的原理和技術. 理解基因操作的工具和基本程序及應用。 學習重點和難點： 重點：提取目的基因的方法。 難點：目的基因導入受體細胞的途徑。 自學測評： 基因工程的基本操作程序主要包括4個步驟：①目的基因的— ② 的構建； ③ 將目的基因 ④ 目的基因的 。 一、 目的基因的獲?。? 1、 目的基因:符合人們需要的，編碼蛋白質的 。 2. 獲取目的基因的方法 （1） 從基因文庫中獲取目的基因 ① 基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多 ，導人受體菌的群體中—,各 個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫.

2、'基因組文庫：含有一種生物的 基因 ② 種類 （CDNA文庫：含有一種生物的 基因 ③ 目的基因的獲取 根據(jù)基因的有關信息：基因的 序列、基因在 上的位置、基因的— 產(chǎn)物mRNA、基因的， 產(chǎn)物蛋白質等特性獲取目的基因。 （2） 利用PCR技術擴增目的基因。 ① PCR：是一項在生物體外 特定DNA片段的核酸合成技術. ② 過程：目的基因DNA受熱形成 ，與 結合,然后在 的作用下進行延 伸形成DNA. ③ 方式：指數(shù)擴增= （n為擴增循環(huán)的次數(shù)） （3）化學方法人工合成:基因較 ，核苷酸序列 。 二、 基因表達載體的構建 1、 表達載體的組成：目的基因+ + +標記

3、基因+ 。 2、 啟動子：位于基因的 ，它是 結合的部位,驅動基因轉錄 產(chǎn)生mRNA。 3、 終止子：位于基因的 ，終 。 4、 標記基因： 受體細胞是否含有目的基因. 5、 表達載體的功能：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并 給下一代;使目的 基因 —和發(fā)揮作用。 6、 不同的受體細胞及目的基因導入受體細胞的方法 ，基因表達載體的構建上也會有 所差別. 三、 將目的基因導入受體細胞 （一）轉化：目的基因進人受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和 的過程。 （二）方法 1、將目的基因導入植物細胞 （1）農(nóng)桿菌轉化法 ① 農(nóng)桿菌特點：易感染 植物和裸子植物，對 植物

4、沒有感染力; Ti質粒的 可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體上。 ② 轉化：目的基因插人 進入〉農(nóng)桿菌一導入植物細胞一目的基因 整合到植物細胞染色體上一目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達 (2) 基因槍法： 植物中常用的一種基因轉化方法，但是成本較高。 (3) 花粉管通道法 2. 將目的基因導入動物細胞 (1) 方法: 。 (2) 操作程序：目的基因表達載體 一取 一顯微注射一注射了目的基 因的受精卵移植到 性動物的 內(nèi)發(fā)育一新性狀動物。 3. 將目的基因導人微生物細胞 (1) 原核生物特點:繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等. (2) 轉化： 處理細

5、胞一 細胞一表達載體與感受態(tài)細胞混合一— 細胞吸收DNA分子。 合作探究、精講點撥： 某生物體內(nèi)全部DMA 栗種生物呆個時期的mRNA 探究一目的基因的獲取 ]限制酶 1反轉錄 1、基因文庫 ? 許參DMA片段 eDNA 勺運載體連接 [hl運栽體連接 1導入 J■導入 文庫 文庫 2.原核細胞和真核細胞的基因結構 (1)原核細胞的基因結構 四、目的基因的檢測與鑒定 類型 步驟 檢測內(nèi)容 方法 結果顯示 水 平檢測 第一步 目的基因是否進入受體細胞 是否成功顯示出雜交帶 第二步 目的基因是否轉

6、錄出mRNA 是否成功顯示出雜交帶 第三步 目的基因是否翻譯出蛋白質 是否成功顯示出雜交帶 水平鑒定 ——非編碼區(qū)——； 編碼區(qū) 非編碼區(qū)- 與RNA糜含酸 ； 結合位點 ； (2)真核細胞的基因結構 非編碼區(qū) 編瑪區(qū) 非編碼區(qū)? 11 ii ^RNA聚合酹 結合位點 /卜顯子\處顯子/艸顯子J : '內(nèi)含子‘ : 3. PCR技術 原理： 前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序

7、列合 條件： 過程： a.變性（ b退火（ °C）：目的基因DNA受熱變性后接連為單鏈 C): 與單鏈相應互補序列結合 C.延伸（ C):在 的作用下進行延伸 Taq酶的特點是 PCR擴增技術與DNA復制的比較 PCR技術 DNA復制 相同點 原理 DNA復制（堿基互補配對） 不 同 占 八、、 解旋方式 DNA在 條件下變性解旋 催化 場所 復制（PCR擴增儀） 主要在 內(nèi) 酶 酶 細胞內(nèi)含有的 能量 結果 在短時間內(nèi)形成大量的 形成整個 探究二 基因表達載體的構建 1 ■1 1

8、卜 m jj ■ ii li i 1?? 1 I爪彈逢農(nóng)瞬 用一定的 切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出 。用 切斷目的基因，使其產(chǎn) 生 。將切下的目的基因片段插入質粒的 處，再加入適量 ，形成了一個 重組DNA分子（重組質粒） 探究三目的基因導入受體細胞——轉化 細胞類型 常用方法 轉化過程 植物細胞 將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上一轉入農(nóng)桿菌一導入植物細胞一 整合到受體細胞的DNA上一表達 動物細胞 將含有目的基因的表達載體提純一取卵（受精卵）一顯微注射一早期 胚胎培養(yǎng)一胚胎移植一發(fā)育成為具有新性狀的動物 微生物 用Ca2處理細胞一感

9、受態(tài)細胞一重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細 胞混合一感受態(tài)細胞吸收DNA分子 探究四目的基因的檢測與鑒定——檢査是否成功 問題1： 受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎? 問題2.試分析真核生物的基因導入細菌細胞后，不能正常發(fā)揮功效的可能原因有哪些? 拓展提高、達標測評： 1．下列正確表示基因操作“四部曲"的是 （ ） A. 提取目的基因一目的基因導入受體細胞一基因表達載體的構建一目的基因的檢測和鑒定 B. 目的基因的檢測和鑒定一提取目的基因一基因表達載體的構建一目的基因導入受體細胞 C. 提取目的基因一基因表達載體的構建一目的基因導入受體細胞一目的基因的檢測

10、和鑒定 D. 基因表達載體的構建一提取目的基因一目的基因導入受體細胞一目的基因的檢測和鑒定 2. 下列不.屬.于.獲得目的基因的方法的是 （ ） A. 利用DNA連接酶復制目的基因 B.利用DNA聚合酶復制目的基因 C.從基因文庫中獲取目的基因 D.利用PCR技術擴增目的基因 3. PCR技術擴增DNA，需要的條件是 （ ） ①目的基因②高溫③四種脫氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖體 A. ①②③④ B.②③④⑤ C.①③④⑤ D.①②③⑥ 4. 根據(jù)mRNA的信息推出獲取目的基因的方法是 （） A. 用DNA探針測出目的基因 B.用mRNA探針測出目的基因 C.

11、用mRNA反轉錄形成目的基因 D.用PCR技術擴增mRNA 5. 在已知某小片段基因堿基序列的情況下,獲得該基因的最佳方法是 （ ） A. 用mRNA為模板逆轉錄合成DNA B. 以4種脫氧核苷酸為原料人工合成 C. 由蛋白質的氨基酸序列推測mRNA D. 將供體DNA片段轉入受體細胞中，再進一步篩選 6. 在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是 460個）放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是 （ ） A. 540 個 B.8100 個 Co 17280 個 D。7560 個 7. 下列不.屬.于.

12、目的基因與運載體結合過程的是 （ ） A. 用一定的限制酶切割質粒露出黏性末端 B. 用同種限制酶切割目的基因露出黏性末端 C. 將切下的目的基因的片段插入到質粒切口處 D. 將重組DNA導入受體細胞中進行擴增 8. 下列哪項不.是.基因表達載體的組成成分 （ ） A.啟動子 B.終止密碼子 C.標記基因 D.復制原點 9o 在基因表達載體的構建中，所需要的酶是 （ ） ①限制酶 ②DNA連接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶 A.①② B.①②③ C.①②④ D.①②③④ 10. 植物學家在培育抗蟲棉時，對目的基因作適當修飾，使目的基因在棉花植株的整個生長 發(fā)育期都表達，以防

13、止害蟲侵害，這種對目的基因所作的修飾發(fā)生在（ ） A.終止子 B.引物 C.標記基因 D.啟動子 11. 下列哪項不.是.將目的基因導入植物細胞的方法 （ ） A.基因槍法 B.顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉化法 D.花粉管通道法 12. 在基因工程操作的基本步驟中，不.進.行.堿基互補配對的是 （ ） A.人工合成目的基因 B. 目的基因與載體結合 C.將目的基因導入受體細胞 D.目的基因的檢測與鑒定 13. 將目的基因導入微生物細胞之前，要用Ca2處理細胞，處理過的細胞叫（ ） A.感受態(tài)細胞 B.敏感性細胞 C.吸收性細胞 D.接受細胞 14?農(nóng)桿菌轉化法轉移目的基因進入受體

14、細胞，目的基因的最終位置是 （ ） A. Ti質粒上 B.受體細胞染色體上 C.裸露細胞核中 D.存在細胞質中 15. 目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測 才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是 （ ） ①檢測受體細胞是否有目的基因 ②檢測受體細胞是否有致病基因 ③ 檢測目的基因是否轉錄mRNA ④檢測目的基因是否翻譯蛋白質 A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④ 16. 要檢測目的基因是否成功地插入了受體 DNA中，需要用基因探針，基因探針是指 （ ） A. 用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B. 用放射性同位素或熒光分子等標記的

15、目的基因 C. 合成B-球蛋白的DNA D. 合成苯丙羥化酶的DNA片段 17. （多選）用基因工程技術可使大腸桿菌合成人的蛋白質。下列敘述正確的是（） A. 常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和質粒 B. DNA連接酶和RNA聚合酶是構建重組質粒必須的工具酶 C. 可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質粒 D. 導入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達 18. （多選）我國科學家運用基因工程技術將蘇云金芽抱桿菌的抗蟲基因導入棉花細胞并成 功表達，培育出了抗蟲棉。下列敘述正確的是 （ ） A. 基因非編碼區(qū)對于抗蟲基因在棉花細胞中的表達不可缺少 B. 重組D

16、NA分子中增加一個堿基對，可能導致毒蛋白的毒性喪失 C. 抗蟲棉的抗蟲基因可通過花粉傳遞至近緣作物，從而造成基因污染 D. 轉基因棉花是否具有抗蟲特性是可以通過檢測棉花對抗生素抗性來確定的 19. （多選）科學家通過基因工程的方法，能使馬鈴薯塊莖內(nèi)含有人奶主要蛋白。以下有關 該基因工程的敘述，正確的是 （ ） A. 采用反轉錄的方法得到目的基因有內(nèi)含子 B. 基因非編碼區(qū)對于目的基因在塊莖中表達是不可缺少的 C. 馬鈴薯的葉肉細胞可作為受體細胞 D. 用同一種限制性內(nèi)切酶分別處理質粒和含目的基因的DNA，可產(chǎn)生黏性末端而形成重 組DNA分子 20. 人體受到病毒刺激后可以產(chǎn)生

17、干擾素干擾素分為a.B. Y三類。1980年生物學家成 功地破譯了a干擾素的全部遺傳信息。并運用插入質粒的方法。用大腸桿菌生產(chǎn).得到的干 擾素可以用于治療肝炎和腫瘤?回答下列問題： （1） 上述材料中涉及到的現(xiàn)代生物技術有 。 （2） 人體中能合成干擾素的細胞 ,合成的場所是細胞中的 。 （3） 在利用大腸桿菌生產(chǎn)干擾素過程中，目的基因 ，所用的運載體是 （4） 目的基因在大腸桿菌中表達時必須經(jīng) 和 過程。 21. 資料顯示，近十年來，PCR技術(DNA聚合酶鏈式反應技術)成為分子生物實驗的一種 常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復制的特性,在試管中進行DNA的人工復制(如下圖)

18、， 在很短的時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使分子生物實驗所需的遺傳物質不再 受限于活的生物體。請據(jù)圖回答： 謡討|棊門一門一開 D砒單鏈 引物DNA單鏈與 游離脫氧核 2條完幕的 模板通過堿基互 昔酸注按到雙鏈D魁分子 祁配對結合 DHA單璉上 (1)加熱至94°C的目的是使DNA樣品中的 鍵斷裂，該過程在生物體細胞內(nèi)是通過 酶的作用完成的。分析可知新合成DNA分子中A=T，C=G，這說明DNA分子的合 成遵循 。 (2) 與細胞內(nèi)DNA復制相比,PCR技術所需要的DNA聚合酶的最適溫度比較 (高、低)。 (3) 通過PCR技術使DNA分子大量復制時，若將一

19、個用15N標記的模板DNA分子(第一代) 放入試管中，以頑標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復制到第五代時，含咽標記的DNA分子 單鏈數(shù)占全部DNA總單鏈數(shù)的比例為 。 (4) PCR技術不僅為遺傳病的診斷帶來了便利，而且改進了檢測細菌和病毒的方法。若要檢 測一個人是否感染了艾滋病病毒，你認為可以用PCR擴增血液中的( ) A.白細胞DNA B.病毒蛋白質 C.血漿抗體 D.病毒核酸 加｛羊囚 22. 下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，請回答下列問題： Fomll 1 Hind IU 1 Smu I 說別庫貿(mào)尺 切割碰點 C*GATCC CCTAG^G A^A

20、GCTT TTCGA^l ATTC CT TAA^C} CCCXiGG 林 LINA (1) 一個圖1所示的質粒經(jīng)Sma I切割前后，分別含有 個游離的磷酸基團. (2)若對圖中質粒進行改造，插入的Sma I酶切位點越多，其熱穩(wěn)定性越 。 (3)用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaI切割，原因 (4) 與只使用EcoR I相比較，使用BamH I和Hind III兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA 的優(yōu)點在于可以防止 。 (5) 為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加 酶。 (6) 重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了 。 (7) 為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的 大腸桿菌突變體，然后在 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因 表達的初步檢測。