多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 擴(kuò)增DNA片斷,溫故知新1:,組成DNA分子的基本單位是什么? 這些基本單位是如何連接成DNA分子的? DNA分子結(jié)構(gòu)有什么特點(diǎn)？,2,A,G,C,T,1、DNA的基本單位脫氧核苷酸,一、DNA分子的結(jié)構(gòu),C,G,A,3,4,5,脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖,磷酸二酯鍵,6,5,5,3,3,7,DNA分子的復(fù)制過(guò)程是怎樣的？ DNA分子的復(fù)制需要哪些條件？,溫故知新2,8,2、時(shí)間：,細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）,1、概念：以親代DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)合成子代在DNA的過(guò)程。,3、場(chǎng)所：主要是細(xì)胞核 （其次是線粒體、葉綠體）,二細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程,9,4、 條件：, 模板： 親代DNA的兩條母鏈 原料： 游離的四種脫氧核苷酸 能量： ATP 酶： 解旋酶 、DNA聚合酶 引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì),5、過(guò)程,（1）解旋：解旋酶 、ATP,（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則，合成子鏈。,（3）子鏈、母鏈螺旋構(gòu)成子代DNA,10,6、復(fù)制特點(diǎn),半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。,7、DNA復(fù)制的方向,DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸,11,12,1、 PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)：是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。 2、原理：利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。,一、基礎(chǔ)知識(shí) （一）PCR原理：,13,體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：,14,DNA母鏈：提供復(fù)制的模板 解旋酶： 打開(kāi)DNA雙鏈 4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料 DNA聚合酶： 催化合成DNA子鏈 ATP：為復(fù)制過(guò)程提供能量 引物：使DNA聚合酶從引物的3端開(kāi)始連 接脫氧核苷酸(一小段RNA),3、PCR反應(yīng)的條件,80100：,耐熱的DNA聚合酶：,緩沖溶液：維持反應(yīng)的pH值不變,(一般是一小段單鏈DNA),15,(二)PCR反應(yīng)的過(guò)程,1、變性：,溫度上升到90以上時(shí),雙鏈DNA解聚成為單鏈。,2、復(fù)性（退火）：,溫度下降到50左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。,3、延伸：,溫度上升到72左右,溶液中的4種脫氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則合成新的DNA鏈。,16,PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性: 雙鏈DNA解聚成為單鏈,17,PCR 循環(huán)第二步 ：引物與模板序列復(fù)性（退火）: 引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合,18,PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸: 合成新的DNA鏈,19,模板序列,模板序列,第1個(gè) PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個(gè)拷貝的序列,20,30次循環(huán)后擴(kuò)增的數(shù)量,21,4、PCR 循環(huán)的結(jié)果, DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。,從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸。,22,第一輪結(jié)果,1,2,3,4,1,2,3,4,第二輪結(jié)果,23,二、 實(shí)驗(yàn)操作,1、PCR儀,（一）設(shè)備及用具,實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。,2、微量離心管,一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml。,3、微量移液器,用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。,24,PCR儀,25,26,1、準(zhǔn)備,2、移液,（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟,按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上,用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑,27,過(guò)程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。,注意：,3、混合,B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻。,A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢。,28,將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。,過(guò)程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。,4、離心,5、反應(yīng),離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。,29,30,PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：,6、注意事項(xiàng),隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；,分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭,一次性吸液槍頭用一次更換一次。,31,（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算,三、課題成果評(píng)價(jià),1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為：2n,2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為：a2n,（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定,1 、原理,可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。,32,2 、過(guò)程,稀釋,2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋。,對(duì)照調(diào)零,以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。,取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值。,計(jì)算,33,計(jì)算,DNA含量（ g ） 50 x（260nm的讀數(shù)）x稀釋倍數(shù),公式中50的含義：50g /ml的DNA在標(biāo)準(zhǔn)厚度為1cm比色杯中的吸光值為1。,34,比色杯,35,（三）DNA片段擴(kuò)增失敗的原因,可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?36,四、 課題延伸,例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝。,PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異性強(qiáng)、敏感性高、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出特點(diǎn)。,37,五、實(shí)驗(yàn)小結(jié),PCR儀加熱使（ ）變性, 復(fù)性使引物與模板DNA（ ）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( ),在（ ）的作用下,以 （ ）為原料,以（ ）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（ ）三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。,模板,互補(bǔ),Taq聚合酶,四種脫氧核苷酸,引物,變性、復(fù)性和延伸,72,38,課堂小結(jié),39,練習(xí)鞏固,1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是 A 古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定 B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué) C DNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案 D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定,40,2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？,3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是 A 原理簡(jiǎn)單 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐熱性 D 快速、高效、靈活、易于操作,從子鏈的5端向3端延伸,41,4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是 A 反復(fù)洗滌 B 不怕外源DNA污染 C 高壓滅菌 D 在20 儲(chǔ)存,42,