,味精的制作,一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1掌握谷氨酸發(fā)酵的原理及發(fā)酵過(guò)程的控制和操作 2掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌的基本技術(shù)、谷氨酸菌種制備及種 子擴(kuò)大培養(yǎng)。 3了解用等電法從發(fā)酵液回收谷氨酸的方法。 4掌握由谷氨酸制備谷氨酸鈉的方法。 二 實(shí)驗(yàn)原理 味精,也稱味素,因味精起源于小麥,俗稱麩酸鈉、谷氨酸鈉（分子式C5H8NO4Na ）。谷氨酸是由谷氨酸棒桿菌以葡萄糖為原料生產(chǎn)的一種呈味氨基酸，其代謝機(jī)理為：葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP）和單磷酸己糖途徑（HMP）生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定作用生成草酰乙酸，兩者合成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），由三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化下，還原氨基化合成谷氨酸。由于谷氨酸棒桿菌為生物素缺陷型突變株，要在培養(yǎng)基中添加亞適量（濃度應(yīng)在5g/L左右）生物素維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和控制細(xì)胞膜的透性達(dá)到高產(chǎn)谷氨酸的目的。回收的谷氨酸又稱麩酸，并無(wú)鮮味，將其進(jìn)行中和精制得到味精。,等電點(diǎn)法提取谷氨酸原理,谷氨酸具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)，溶于水呈離子狀態(tài)，解離方式取決于溶液pH，在不同pH溶液中，谷氨酸可解離成GA+、GA、GA-和GA2+四種不同離子狀態(tài)。谷氨酸等電點(diǎn)是3.22，故當(dāng)溶液的pH為3.2時(shí)，溶液中大部分是GA兩性離子，其分子內(nèi)部正負(fù)電荷相等,并含有等量的帶不同電荷的陽(yáng)離子(GA+)和陰離子(GA-),因此溶液中總靜電荷等于零。由于谷氨酸分子之間相互碰撞,再通過(guò)靜電引力的作用,結(jié)合成較大的聚合體而被沉淀析出,因而處于等電點(diǎn)時(shí)GA的溶解度最小。谷氨酸在不同條件下結(jié)晶，會(huì)形成兩種不同晶形，一種為型斜方晶體，顆粒大，容易結(jié)晶析出，純度高；一種為型鱗片狀結(jié)晶，比重輕，不宜沉淀分離，往往夾有雜質(zhì)與膠體結(jié)合，浮于液面或母液中，純度低。等點(diǎn)操作中應(yīng)盡量控制型晶體的形成。又由于溫度對(duì)GA的溶解度影響很大,溫度越低溶解度越小,生產(chǎn)上多采用04。,三 實(shí)驗(yàn)用品 一）儀器：試管、三角燒瓶、紗布、吸管、接種環(huán)、試管、燒杯、752（7200）分光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、電子天平、超靜工作臺(tái)、10L自動(dòng)發(fā)酵罐、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、搖床、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等 二）菌種 谷氨酸棒桿菌 （實(shí)驗(yàn)室提供） 三）培養(yǎng)基 1.斜面培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉 0.5，蛋白胨 1，氯化鈉 0.5，pH 7.0 121滅菌30min,2種子培養(yǎng)基（g/L）： 葡萄糖 25，玉米漿 30（2330），MgSO4 0.5， K2HPO4 1.5， MnSO4 0.02， FeSO4 0.02，尿素 5。 pH值7.07.2 121滅菌30min 3發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）： 葡萄糖 140、糖蜜 2.0（玉米漿6）Na2HPO4 1.0， KCl 1.2，MgSO4 0.8，MnSO4 0.02， FeSO4 0.02，VB1 0.2mg，pH 7.07.2。 4補(bǔ)料溶液： 葡萄糖600g/L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%尿素（氨水 25%） 5消泡劑0.01%（消泡劑配制后經(jīng)滅菌、冷卻后備用),四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 （一）工藝流程 原料的預(yù)處理及淀粉水解糖的制取谷氨酸生產(chǎn)菌種子的擴(kuò)大培養(yǎng)谷氨酸發(fā)酵谷氨酸的提取與分離由谷氨酸制成味精及味精成品加工 （二）實(shí)驗(yàn)步驟 1 斜面菌種制備：接種針挑取1環(huán)原始菌種，于斜面培養(yǎng)基劃線，在恒溫培養(yǎng)箱32 培養(yǎng)18-24h。 2液體種子培養(yǎng)：接一環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面種子至裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶（1000ml裝200-250ml），放在沖程為8cm的往復(fù)式搖瓶柜上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 96rmin，溫度 32，培養(yǎng)8-9h。 一級(jí)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： pH 6.5 光密度 OD0.75以上 殘?zhí)?.5%以下 鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)雜菌，八字形占95%以上由于發(fā)酵罐的容積較小，所以省略了二級(jí)種子的培養(yǎng)。,3-1 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng) 1培養(yǎng)基配制 按發(fā)酵培養(yǎng)基配制，用自來(lái)水定容至發(fā)酵罐容積的60%，pH調(diào)至7.0-7.2。 2）滅菌 空消及空氣過(guò)濾系統(tǒng)滅菌 滅菌前檢查發(fā)酵罐及相關(guān)管路氣密性，121滅菌30min，滅菌過(guò)程打開(kāi)各路排氣閥門，空氣過(guò)濾系統(tǒng)滅菌后通壓縮空氣吹干備用。 (罐小，可省略) 2）實(shí)消 發(fā)酵罐加入培養(yǎng)基后，通過(guò)夾套預(yù)熱至80，直接通蒸汽滅菌，121滅菌20min，再關(guān)閉蒸汽，改用自來(lái)水冷卻至32。滅菌完畢通無(wú)菌空氣保持罐內(nèi)正壓，防止染菌。,3）發(fā)酵工藝條件 采用火焰接種法接種，接種量10% 罐壓控制在0.05MPa 轉(zhuǎn)速200750r/min，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速及通氣量控制溶氧在20%以上 當(dāng)pH降到7.07.1左右，及時(shí)流加尿素（氨水）。 前期pH7.58.0， 中期降到7.17.4，后期7.0，在發(fā)酵結(jié)束前6小時(shí)停止流加尿素（氨水） ，接近放罐時(shí)pH約6.56.8 溫度：0-5h 34；5-10h 35；10-18h 36；18h26h 37；26h后37,OD凈增控制: 總OD=0.750.8。 殘?zhí)菨舛韧ㄟ^(guò)流加葡萄糖液（殘?zhí)窃?%2.0%時(shí)是流加糖最佳時(shí)機(jī)）控制在10-15g/L。發(fā)酵周期在36h內(nèi)，放罐時(shí)殘?zhí)菓?yīng)低于5g/L。流加糖占總投糖的 60%70%時(shí)產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率較為理想。開(kāi)始流加時(shí)機(jī)應(yīng)以殘?zhí)橇?、耗糖速度、菌體的活力和轉(zhuǎn)型情況為依據(jù) 泡沫控制：在發(fā)酵產(chǎn)生一定泡沫時(shí)，流加一定量的消泡劑，每次流加約40g/m3 。,4）放罐 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至80維持15min滅菌，并清洗發(fā)酵罐及補(bǔ)料瓶。 從發(fā)酵4小時(shí)開(kāi)始，每間隔2小時(shí)測(cè)定OD，pH，糖含量，鏡檢 3-2 發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵 取種子培養(yǎng)液以10%接種量接種至裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，8層紗布封口，置巡回式搖床(220r/min)上振蕩培養(yǎng) 36h。添加 2滴1%苯酚紅指示劑，間歇流40加尿素控制 pH 在 7.0 左右。溫度：前期3233，后期3437 。轉(zhuǎn)速：前期100rmin，后期220r/min。,6 谷氨酸的提取與分離等電點(diǎn)法提取工藝操作簡(jiǎn)單，收率60。周期長(zhǎng)，占地面積大,晶種 4h 發(fā)酵液菌體分離清液（濃縮） 育晶點(diǎn)停酸攪拌兩小時(shí)邊冷卻邊緩慢調(diào)酸 2M HCL 等電點(diǎn)低速攪拌結(jié)晶68h 4靜置沉降4h濕谷氨酸離心分離谷氨酸 母液 1)發(fā)酵液預(yù)處理 采用金屬過(guò)濾膜過(guò)濾設(shè)備去除菌體及固形物雜質(zhì)，必要時(shí)可在膜過(guò)濾前添加絮凝劑沉淀蛋白質(zhì)雜質(zhì)，添加發(fā)酵液體積1.5%的粉末活性炭在80下對(duì)發(fā)酵液脫色20min，在510nm下透光值達(dá)到75%以上。,2）發(fā)酵液濃縮 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70、-0.1 MPa真空度下濃縮發(fā)酵液體積至原體積的50%。 3）等點(diǎn)結(jié)晶 采用2M HCL調(diào)節(jié)谷氨酸濃縮液pH至3.2，并緩慢攪拌育晶8h 4）晶體分離及干燥 采用真空抽濾設(shè)備分離谷氨酸晶體，60烘干并稱重。 7 谷氨酸制味精 谷氨酸用適量的NaCO3溶液中和后，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾、濃縮、離心分離等步驟、最終制成味精。 工藝條件：濕谷氨酸：水：純堿：活性炭=1：2：（0。30.34）：0.01,1）在不銹鋼內(nèi)桶內(nèi)加入清水及活性炭升溫到65 ，開(kāi)始攪拌60r/min。投入谷氨酸，成為飽和溶液。 2）緩慢逐步加入NaCO3 中和到pH6.4（試紙），加熱到65 ，繼續(xù)攪拌 4）谷氨酸鈉的濃縮結(jié)晶：a.將澄清的脫色液（18-20B/35 ）加到旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀（加料<1/2）,真空度80kPa以上，T<70 濃縮至3434.5 B/80 ，升溫至80 放料。放料后冷卻，攪拌23h后開(kāi)冷卻水降溫，降溫到（室溫+15 ） b.分離 ：抽濾（工業(yè)濾布作介質(zhì)/真空抽濾設(shè)備 ） c.烘干：鼓風(fēng)干燥箱（T<60 ）干燥。即可得到味精原粉。 注 中和液除鐵、除鋅：硫化鈉法、樹(shù)脂法除鐵鋅。,五 注意事項(xiàng) 1菌種制備的整個(gè)過(guò)程牢固無(wú)菌概念，嚴(yán)防雜菌污染。 2流加糖消毒滅菌溫度不宜過(guò)高，切要迅速降溫至3045 ， 105 在攪拌以防止糖液的焦化產(chǎn)生焦糖和色素,流加過(guò)程中殘?zhí)强刂屏坎灰撕龈吆龅汀?3等電點(diǎn)法提取谷氨酸注意A、發(fā)酵液純度高：谷氨酸/殘?zhí)潜戎蹈撸z體少，提前除菌體最好； B、發(fā)酵液處理要及時(shí)；C、加酸調(diào)pH、溫度、育晶時(shí)間、攪拌服從結(jié)晶規(guī)律，特別是觀察到晶體后，要停攪拌2h 育晶，否則產(chǎn)物無(wú)法沉淀。D谷氨酸結(jié)晶操作中要控制條件，避免型結(jié)晶析出。 4中和使用NaCO3，在pH7左右得到谷氨酸一鈉，在pH9-10得到的是谷氨酸二鈉，因此中和應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)的pH。 5注意配料順序：硫酸鎂和磷酸氫二鉀應(yīng)分別溶解，交叉加入,六實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法 1）菌體OD ：吸取0.5ml發(fā)酵液，加入9.5ml水稀釋并搖勻，采用7200分光光度計(jì)于600nm下（752型620nm）測(cè)定吸光值。 2）pH值:在線測(cè)定 3）還原糖含量:用裴林試劑測(cè)定 4）鏡檢：每隔6小時(shí)檢測(cè)菌體的生長(zhǎng)狀況，要求無(wú)雜菌和噬菌體。 5） GA含量：從發(fā)酵12小時(shí)開(kāi)始，每隔4小時(shí)測(cè)定GA含量，GA用茚三酮比色法測(cè)定。 6）糖酸轉(zhuǎn)化率 發(fā)酵液中生成的谷氨酸量和消耗的葡萄糖質(zhì)量的比例。轉(zhuǎn)化率=VtGA%/V0初糖%(Vt 發(fā)酵放罐體積;V0 初始定容體積),七實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每間隔2h取樣一次，分別測(cè)定還原糖、溶氧、通氣量、PH、菌體濃度、谷氨酸含量等指標(biāo)的過(guò)程曲線，繪制谷氨酸發(fā)酵過(guò)程曲線圖，并解釋曲線變化的原因。 2、計(jì)算谷氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率、谷氨酸提取收率等指標(biāo)；以發(fā)酵零小時(shí)的投入糖量除以發(fā)酵終了的谷氨酸總質(zhì)量，得到谷氨酸的轉(zhuǎn)化率。 3比較各小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評(píng)價(jià)本小組谷氨酸發(fā)酵及味精制作的結(jié)果，總結(jié)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的得與失。 4根據(jù)所得產(chǎn)量，分析影響味精產(chǎn)量的因素。,八 思考題 1為什么以尿素為氮源的發(fā)酵控制中，增加風(fēng)量和提高溶氧會(huì)造成發(fā)酵液PH的上升？ 2以谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化規(guī)律為例，說(shuō)明為什么pH值的變化是反應(yīng)過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的綜合性指標(biāo)？ 3發(fā)酵過(guò)程實(shí)現(xiàn)高的產(chǎn)酸，應(yīng)如何防止雜菌及噬菌體感染？,主要參考文獻(xiàn) 發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 吳根福 主編 高等教育出版社 2006.5ISBN7-04-018619-5 生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn) 賈世儒 主編 中國(guó)輕工業(yè)出版社 2004.7 ISBN7-5019-4390-7 固定化原生質(zhì)體半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸 文章編號(hào)0254-5071（2010） 06-0121-02 繆靜 馮志彬 呈顯好 張玉香 程仕偉 張健勇 Intnert 謝謝 ！,緩沖 溶 液 的 制 備 : 配 制p H 6 . 0 的NaAc - HAc 緩沖溶液。 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制:用天平準(zhǔn)確稱取1. 0000g谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,溶于 1L 緩沖溶液中。 再采用逐級(jí)稀釋法配得濃度為 80 g/ mL、90 g/ mL至140 g/ mL 的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。 茚三酮試劑的制備:稱取 0. 5g 茚三酮溶于 100mL 水中得到 5g/ L 的茚三酮水溶液。 1 實(shí)驗(yàn)方法 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 分別吸取 80140g/ mL 的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液 5mL 于 25mL 的比色管中 ,各加入 1mL 的茚三酮試劑 ,加上塞充分搖勻。將其置于90 下水浴 2025 min ,冷卻至室溫 ,用 7200 型分光光度計(jì)在 569nm 下測(cè)得其光密度值2 。以標(biāo)準(zhǔn)液的光密度值和濃度做一標(biāo) 準(zhǔn)曲線。 3 樣品的測(cè)定 稀釋待測(cè)液于 80140g/ mL 內(nèi)(谷氨酸發(fā)酵液濃度一般在 8 %14 % ,測(cè)量時(shí)稀釋1000 倍即可) ,調(diào)p H 為6. 0。以同樣的反應(yīng)量與反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng) ,并在 569nm 下測(cè)定其光密度值。由以上所得標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)查得待測(cè)稀釋液的濃度 ,再乘以稀釋倍數(shù)即為谷氨酸待測(cè)液的濃度。,