4 莖尖分生組織培養(yǎng),一、概念和意義 1.概念 莖尖分生組織培養(yǎng)：指對不超過0.1mm的莖尖或幾十微米的莖尖進行的培養(yǎng)。 特點：可獲無病毒苗，操作困難，成苗時間長。 普通莖尖培養(yǎng)：對幾毫米至幾十毫米長的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)。操作技術(shù)簡單、易成活、成苗時間短、繁殖速度快。,2.意義 莖尖培養(yǎng)在園藝植物離體培養(yǎng)中最常見，可快速繁殖無性系、培養(yǎng)無病毒苗、品種改良。 二、莖尖分生組織培養(yǎng)一般方法 1.材料的制備 健壯枝梢 去除葉片 分成1-2cm 自來水沖洗 消毒 75%的酒精30秒 0.1%升汞或20倍次氯酸鈉消毒8-10min 無菌水 修剪剝離莖尖，通常切割下頂端0.20.5 mm葉原基的莖尖（無菌水） 接種。,2.培養(yǎng)基 多為MS培養(yǎng)基及其改良配方，還有White、B5、Heller、Gautheret等。 3.培養(yǎng)條件 （1）溫度：2628 （2）光照：光培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)好。 （3）濕度：與其他器官培養(yǎng)相似。,4.3 脫毒苗的培育和病毒檢測,一、脫毒苗的培育 （一）脫毒苗培育的意義 全世界已發(fā)現(xiàn)植物病毒有近700種，植物病毒病嚴重地影響果樹、蔬菜、花卉、林木等植物的生長，造成產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，其危害僅次于真菌病害。受病毒浸染的植物終身帶毒，目前尚無藥物可以治愈。通過莖尖分生組織脫毒、熱處理脫毒等方法可脫除植物體內(nèi)病毒，恢復植物原有特性。,（二）熱處理脫毒 1.原理 熱處理脫毒又叫熱溫處理或熱療法。其基本原理是一些病毒對熱不穩(wěn)定，在高于常溫的溫度下（35-40度）既鈍化失活。 2.熱處理法有：溫湯處理（熱水浸泡）和熱風處理兩種。,具體方法： 第一，熱水浸泡處理，適用于切下的材料，在50度左右的溫水中浸漬數(shù)分鐘至數(shù)小時，方法簡便易行但材料易受傷。 第二，熱風處理，將生長的盆栽植物移入室內(nèi)或生長箱內(nèi)，處理溫度因植物種類、生理狀況而異。一般為3540度，短則幾十分鐘，長達數(shù)月。,（三）莖尖培養(yǎng)脫毒 1.莖尖培養(yǎng)脫毒的原理 （1）病毒在植物體內(nèi)的分布 病毒濃度不同，離尖端越遠病毒濃度越高。莖尖或根尖離體培養(yǎng)便可獲得無病毒再生植株。 必須指出的是，所謂無病毒，只是相對的，不是絕對的。 （2）莖尖大小與脫毒 莖尖外植體的大小與脫毒效果成反比。莖尖分生組織不能合成自身需要，生長素，細胞分裂素，因而帶葉原基的莖尖生長快，成苗率高。因此莖尖越大培養(yǎng)成活率越高。因此對不同植物脫毒適宜的莖尖大小不同。,2.莖尖培養(yǎng)脫毒的方法 （1）取樣與消毒 可直接選定的植株上取頂芽進行消毒接種。采頂芽與側(cè)芽消毒接種。 消毒方法是：剪取頂芽梢段3、5厘米，剝?nèi)ゴ笕~片，用自來水沖洗干凈，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸鈉或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用無菌水沖洗材料4-5次。,（2）接種 材料置1040倍的雙筒解剖鏡下，解剖刀切取0.10.3mm帶有12個葉原基的莖尖，接種到培養(yǎng)基上。,（3）培養(yǎng) 接種后材料置25+2 ，光照度1500-5000LX，每日光照10-16h條件下培養(yǎng)。但一般光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好。其間應更換新鮮培養(yǎng)基。提高培養(yǎng)基中BA的濃度可形成大量從生芽。 3.培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式 ： （1）培養(yǎng)基：常用MS， White等培養(yǎng)基。 （2）培養(yǎng)方式：莖尖培養(yǎng)一般采用半固體培養(yǎng)基,（四）、其他脫毒方法 1.熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒 2.微體嫁接脫毒 微尖嫁接技術(shù)（micrografting shoot-tip），指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)實生砧木，嫁接無病毒莖尖（0.14-1.0mm,帶3-4個葉愿基）以培養(yǎng)脫毒苗的技術(shù)。 主要脫毒程序是：無菌砧木培養(yǎng) 莖尖準備 嫁接 嫁接苗培養(yǎng) 移植。 3.抗病毒藥劑脫毒,二、病毒檢測 主要是對脫毒苗的鑒定。方法有 1.直接測定法：直接觀察待側(cè)植株生長狀態(tài)是否異常，莖葉上有無特定病毒引起的可見癥狀，從而可判斷病毒是否存在。 2.指示植物法： 將一些對病毒反映敏感，癥狀特征顯著的植物作為指示植物（鑒定別寄生），用以檢驗待測植物體內(nèi)特定病毒的存在。即指示植物法。常用鑒定指示植物有莧科植物千日紅和藜屬筧色藜。 特點：條件簡單，操作方便，故一直沿用至今，仍為一種經(jīng)濟而有效的鑒定方法，只能測出病毒的相對感染力。,3.抗血清鑒定法 植物病毒是由核酸和蛋白質(zhì)組成的核蛋白復合體，因而也是一種抗原，注射到動物體內(nèi)即產(chǎn)生抗體，抗體存在于血清之中，稱為抗血清。由于不同病毒產(chǎn)生的抗血清都有特異性，用特定病毒的抗血清來鑒定該種病毒，具有高度的專一性和特異性，幾分鐘至幾小時即可完成，方便簡易，為常用方法之一。,三、無病毒苗的保存和繁殖,（一）無病毒苗的保存 無病毒植株并不是有額外的抗病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應很好保存，這些原原種或原種材料保管得好可以保存利用510年。 1.隔離保存,通常無病毒苗應種植在隔蟲網(wǎng)內(nèi)，使用300目，即網(wǎng)眼為0.40.5mm大小的網(wǎng)紗，也可用盆栽缽，可以防止蚜蟲、葉蟬、土壤線蟲進入。栽培用的土壤也應進行消毒，周圍環(huán)境也要整潔，并及時噴施農(nóng)藥防治蟲害，以保證植物材料在與病毒嚴密隔離的條件下栽培。有條件的地方可以到海島或高冷山地種植保存，那里氣候涼爽，蟲害少，有利于無病毒材料的生長，繁殖。另一種更便宜的方法，是把由莖尖得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗的植物通過離體培養(yǎng)進行繁殖和保存。,植物離體快速繁殖,植物離體快速繁殖又稱微體快繁（微繁）：是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行的一種營養(yǎng)繁殖方法；是在無菌條件下，把離體的植物器官、組織，放在人工控制的環(huán)境中，使其分化、繁殖，在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量遺傳性一致的完整新植株的技術(shù)。,植物離體快速繁殖的優(yōu)點： 1.繁殖系數(shù)高，繁殖周期短，繁殖速度快 2.應用廣泛，是推廣良種的重要手段 3.繁殖材料用量少，不受季節(jié)限制，可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn) 4.能獲得無菌苗木無性系 5.木本植物應用潛力大,植物離體快速繁殖的基本程序： 1.穩(wěn)定無菌培養(yǎng)體系的建立時期 是指從外植體選擇、采取、清洗、滅菌、接種和莖芽發(fā)生，一直到獲得莖芽穩(wěn)定生長和增殖，莖芽擴繁數(shù)量可以隨意控制的整個時期。 本時期主要包括外植體選擇、外植體滅菌、培養(yǎng)基選定和穩(wěn)定化培養(yǎng)等環(huán)節(jié)。,2.穩(wěn)定培養(yǎng)系的增殖、生長和增壯時期 是指使已經(jīng)達到穩(wěn)定狀態(tài)的培養(yǎng)物，通過不斷的繼代培養(yǎng)進行增殖，從而達到所要求的數(shù)量；培養(yǎng)增殖后的培養(yǎng)物生長和壯大到生根所需要的大小和壯實程度的時期，是商品化組織培養(yǎng)的主要時期。 此階段是整個商品化培養(yǎng)過程的關(guān)鍵?？旆钡哪康木褪窃谧疃痰臅r間內(nèi)生產(chǎn)最多的優(yōu)質(zhì)苗木。,3.誘導莖芽生根形成小苗時期 本時期是使上一期培養(yǎng)出的微枝發(fā)出不定根，形成完整的小苗，以便經(jīng)過馴化，培養(yǎng)成商品苗。 4.生根小苗移栽和馴化時期 這個階段是將已生根的完整植株從培養(yǎng)室移植到室外土壤中，使小苗繼續(xù)長大。 即是所說的試管苗馴化。,試管苗馴化,試管苗馴化過程也叫煉苗，這是組織培養(yǎng)技術(shù)應用于生產(chǎn)實踐面臨的一個重大問題。要使試管苗移栽成功要做好以下工作： 1.培育壯苗（內(nèi)因） 2.選擇合適的移栽介質(zhì) 3.注意移栽方式 4.加強載后的環(huán)境調(diào)控,