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1、原位分子雜交技術(shù),原位雜交 (in situ hybridization,ISH) 是應用已知堿基順序并帶有標記的核酸探針與組織、細胞中的待測的核酸按堿基配對的原則進行特異的結(jié)合而形成雜交體。,再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶有顏色的雜交信號，在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。,DNA---DNA; RNA---DNA; RNA---RNA 人工合成寡核苷酸---DNA(RNA),常用方法： 膜上雜交：用醋酸纖維膜和尼龍膜等作為 載體，將靶基因轉(zhuǎn)移到膜上，然后用探針 進行雜交，陽性結(jié)果顯示為條紋或斑點。,液相雜交：以生物素或丫啶翁酯標記探針在溶液中

2、用羥基磷灰石層析或吸附、親和吸附、磁珠吸附等方法進行雜交，結(jié)果于計數(shù)器，光度計或用化學發(fā)光測定。,原位雜交：在具有明確的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上， 如一個細菌，一條染色體，細胞或組 織上進行核酸雜交，可以檢測到特定 基因的準確定位。,原位雜交技術(shù)的出現(xiàn)是組織化學和免疫組織化學的革命性突破。,一、 原位雜交的分子生物學基礎(chǔ)： （一）核酸的分子結(jié)構(gòu)： C 、H、 O、 N、 P* 核酸水解多聚核苷酸水解核苷、磷酸水解戊糖、含氮堿（堿基）、磷酸。,（二）核酸的一級機構(gòu)： 堿基共同成分： 腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胞嘧啶(C)； 區(qū)別：DNA含有胸腺嘧啶(T)；RNA含有尿嘧啶(U)。,（ 三 ）核

3、酸的高級結(jié)構(gòu)：根據(jù)堿基配對規(guī)律 DNA：多核苷酸鏈可形成雙螺旋三、四股螺旋；但有高溫變性，低溫復性的特點。RNA：多核苷酸鏈一般以單鏈存在，僅有時局部形成小雙螺旋結(jié)構(gòu)。,二、 原位雜交的發(fā)展史： 1 、1969年美國耶魯大學Gall和Pardue 首創(chuàng)用爪蟾核糖體基因探針與卵母細 胞雜交，雜交點定位于核仁。同年， Buongiorno-Nardelli等用同位素標記 核酸探針對細胞和組織進行定位。,2、1970年Orth 用3H標記兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針在冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術(shù)檢出細胞中的病毒DNA。,3、1981年Bauman 應用熒光素標記cRNA探針，在熒光顯微鏡觀察

4、成功。,4、1983年Brigat首建生物素標記的探針在組織切片上檢出病毒DNA.,5、1987年Biochemisca 推出地高辛標記的試劑及藥盒。,三、核酸探針的分類： 按標記方法分： 1、放射性探針：用放射性同位素32P、35S、3H標記，通過放射自顯影方法顯示。 特點：靈敏度高，輻射危害，耗時久，半衰期限制。,2、非放射性探針：用FITC, Biotin, DIG, HRP, AP 標記，用相應的檢測系統(tǒng)顯示。 特點：靈敏度也高，安全，快速，廣泛應用。,按探針的性質(zhì)分： 1、DNA探針： 雙鏈：采用PCR方法，從基因庫釣取或 人工合成。,單鏈：將DNA片段裝載到質(zhì)?；蚓w中，

5、以此為模板用Taq酶合成互補單DNA探針或以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈 cDNA探針。,特點：雙鏈長度較長（數(shù)百數(shù)千個鹼基），信號強， 但滲透性差。單鏈較好。,2、RNA探針：一般為單鏈；采用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)（單向或雙向），用新型載體pSP和pGEM，在SP6 RNA或T7 RNA聚合酶作用下進行RNA轉(zhuǎn)錄而成。 特點：長度隨意，穩(wěn)定，信號更強。,3、寡核苷酸探針：已知基因序列，由核酸合成儀合成。 特點：鏈短，雜交速度快，特異性強，價廉質(zhì)穩(wěn)。,四、原位雜交技術(shù)的應用： 1、基因芯片（基因組圖）； 2、基因表達定位； 3、轉(zhuǎn)基因檢測。,4、核DNA和 RNA 的mRNA的排列和運輸，復制和

6、細胞分類 5、細胞遺傳學、產(chǎn)前診斷、腫瘤診斷 6、病毒學和病原學、傳染性疾病的診斷 7、生物學劑量的測定,五、原位雜交技術(shù)的基本方法： 包括： 1、雜交前準備：固定、取材、 玻片和組織處理，增強核酸探針的穿透性，減低背景染色等。 2、雜交： 3、雜交后處理： 4、顯示：放射自顯影，組化 或免疫組化顯色。,（一）固定：DNA 較穩(wěn)定，mRNA次之， RNA 最易被酶降解。,固定液： (1) 4%的多聚甲醛（加1/1000 DEPC） (2) 冰醋酸酒精 (3) Bouin 固定劑 (4) 冰凍切片直接在(1)液10min,（二）玻片處理：載玻片經(jīng)熱肥皂水刷洗---清潔液浸泡24h----95%

7、酒精浸泡24 h---蒸餾水沖洗----1500C以上烘箱過夜。,玻片粘附劑：多聚賴氨酸，APES。 蓋玻片應做硅化處理。,（三）防止RNA酶污染： 1、整個實驗過程均需戴消毒手套。 2、實驗用玻璃器皿在實驗前一日置高 溫 （2400C）烘烤，以破壞RNA酶。,（四）、增強組織的通透性和核酸探針的穿透性： 1、Triton X-100 2、蛋白酶K（Proteinase K 1ug/ml） 37 0C 1520 min 3、胃蛋白酶（Pepsin 20100ug/ml） 37 0C 30 min 上述酶消化后用4%多聚甲醛后固定。,（五） 減低背景染色 1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗

8、，以減低靜 電效應。 2、雜交后酶處理。 3、雜交后洗滌。,（六） 預雜交：用不含探針和硫酸葡聚糖的液體封閉非特異性雜交點。,雜交： 1、 滴加雜交液：輕加，不產(chǎn)生氣泡，或用DAKO筆沿組織周圍劃圈。加硅化蓋玻片（無菌蠟膜也可）。 2、蓋玻片周圍加液體石蠟或用橡皮泥封固，以防雜交液蒸發(fā)。 3、組織切片置于盛有2SSC溶液的濕盒中孵育。,（八）雜交后處理： 1、用含低濃度RNA酶（20ug/ml）液將切 片的非堿基配對的RNA除去。 2、鹽溶液（SSC）濃度由高到低，溫度 由低到高。 3、切片切忌干燥。,（ 九）顯示（使用檢測系統(tǒng)）： 1、放射自顯影（略）。

9、 2、酶檢測系統(tǒng)（與免疫組化同）。,（十）對照實驗：根據(jù)實際情況定。 1、將切片用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交。 2、吸收試驗：用cDNA或cRNA探針進行預雜交。,1、置換試驗：用與載體非特異的序列和 不相關(guān)探針雜交。 2、空白試驗：用未標記探針或不加探針 的雜交液進行雜交。 3、用已知確定為陽性或陰性組織進行 雜交對照。,六、原位雜交實際操作舉例：,DNA 與mRNA原位雜交步驟 1、 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟到水。 2、3%H2O2室溫處理10分鐘（以滅活內(nèi)源 性過氧化物酶）蒸餾水洗。,3、暴露DNA/mRNA核酸片段： (1) DNA: 蛋白酶K（10ug/m

10、l) 室溫消化10分鐘； （2）RNA:胃蛋白酶370C消化30分鐘。 4、0.5M PBS洗3次5分鐘，蒸餾水洗1次。,DNA雜交： 1、切片置于2SSC中，微波爐加熱95 10010分鐘；迅速插入冰水2分鐘； 2、DNA探針于90 水中10分鐘,迅速插入碎冰3分鐘；,5、雜交：切片在空氣干燥后，按每張切片加20l含地高辛標記的DNA/RNA探針原位雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上，恒溫箱37 400C過夜。,6、雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，30-370C 左右水溫的2SSC洗滌5分鐘3次。 7、滴加雜交探針穩(wěn)定液37-400C 反應4-6小時（此步可省略）。 8、0

11、.2SSC洗滌5分鐘3次。,9、滴加封閉液：室溫20分鐘，不洗。 10、滴加兔抗地高辛：370C ，60分鐘。 11、 0.5M PBS洗5分鐘3次。 12、滴加生物素化羊抗兔IgG，370C， 30分鐘。 13、0.5M PBS洗5分鐘3次。,14、滴加S-P試劑: 370C，30分鐘。 15、0.5M PBS 洗5分鐘4次。 16、DAB顯色：20-30分鐘，充分水洗。 17、酒精脫水，二甲苯透明，封片。,七、 結(jié)果判斷： 1、DNA原位雜交的陽性信號一般存在于細胞核內(nèi)。 2、RNA原位雜交的陽性信號位于胞漿內(nèi)。,生殖細胞瘤16號染色體 ISH,HER2熒光原位雜交

12、,皮膚鱗狀上皮細胞核HPV DNA（+） ISH,宮頸粘膜 上皮HPV16（+） ISH,宮頸粘膜上皮HPV16（+） ISH,宮頸鱗癌HPV18(+)，ISH,鼻咽癌 EBER(+), ISH,腎小管上皮細胞核HBVDNA（+），ISH,食管粘膜基底層細胞質(zhì) Egr-1 mRNA（+），ISH,食管鱗癌細胞質(zhì) Egr-1 mRNA（+）， ISH,食管鱗癌細胞質(zhì) CyclinD1mRNA（+）， ISH,胃腺癌細胞質(zhì)端粒酶hTR(+), ISH,肝細胞癌 CD44V6 mRNA（+）， ISH,肝細胞癌 整合素 a5 mRNA（+）， ISH,乳腺癌細胞質(zhì)PR mRNA(+), ISH,腦星

13、形細胞瘤 血小板生長因子 mRNA（+）， ISH,3、 陽性信號的評定（半定量）： （1）陽性細胞數(shù)：陽性細胞 10% 、 30%、 70%和70%分別為 1、 2、 3、4分。 （2）陽性著色強度：按弱、中、強三 級分別為 1、2、3分。,4、 用計算機輔助的圖像分析、顯微分光度計或圖像分析儀對不同類型核酸顯色數(shù)量和強度進行檢測。,七、原位雜交結(jié)合免疫組織化學雙標記法： 原位分子雜交檢測DNA或RNA，能進行基因定位或在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達； 免疫組織化學檢測細胞和組織內(nèi)蛋白抗原 成分，在翻譯水平上研究基因表達。二者 結(jié)合起來，形成一個新的分子檢測系統(tǒng)， 對于深入研究基因擴增、表

14、達的調(diào)控與疾 病的發(fā)生機理有廣泛的應用前景。,注意事項： 1、先做原位雜交（因mRNA易被降 解），后做免疫組化。 2、做原位雜交時應適當減低漂洗溫度， 以減少生物活性肽或蛋白的丟失。,3、原位雜交完成后不顯色，在加堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體時混入免疫組化的第一抗體。 4、用上述方法必須是雙酶雙標，即分別用鹼性磷酸酶和辣根過氧化物酶。,5、用不同的顯色液，一般先用DAB, 后用 CIP/NBT顯色，分別顯成棕黃色和紫藍色。 6、陽性細胞可為棕或藍單色或為藍棕混合色。,腎小管細胞核HBVDNA，細胞質(zhì) HBsAg 雙（+），ISH-IHC,肝細胞HBVDNA ，HBsAg 雙

15、（+）， ISH-IHC,原位雜交是一個很復雜的操作過程，許多條件不好掌握。尤其對初作此項工作的人往往面對失敗而束手無策；但目前國際、國內(nèi)許多公司已推出一系列成套的原位雜交檢測試劑盒，可方便使用。,試劑盒內(nèi)包括：蛋白酶K，含標記探針的雜交液，封閉液及檢測系統(tǒng)等主要試劑；由于每種試劑都經(jīng)過最優(yōu)化檢測后配制， 所以成功率高，操作也簡便，使原位雜交在一般實驗室進行成為可能。,The End,細胞凋亡檢測技術(shù),一 、前言：凋亡（Apoptosis） 程序性細胞死亡 （programmed cell death, PCD） 細胞自身的一種主動的生理性死亡過程，一種不同于壞死的死亡方式；是由基因控制的細胞

16、自我消亡過程。,光學顯微鏡HE染色觀察凋亡細胞： 核染色質(zhì)濃縮、碎片形成（為時已晚）。 原位末端標記凋亡細胞：可有或無上述特征（早期觀察）。,*細胞凋亡時內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的3OH末端；利用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶將地高辛標記的dUTP結(jié)合在3OH末端，再通過酶聯(lián)反應，最后用顯色劑予以顯色。,二、凋亡檢測技術(shù)： 1、原位細胞凋亡； 2、凝膠電泳； 3、流式細胞術(shù)； 4、激光掃描。,三、凋亡細胞的形態(tài)學： 普通光學顯微鏡下形態(tài)：,1、組織處理：一般無特殊。 （1）培養(yǎng)細胞應低速離心（250r/m

17、in）5分鐘，避免破碎。 （2）防脫片：1%牛血清白蛋白、卵蛋白、處理玻片。,2、染色方法： （1）普通HE染色； （2）Giemsa 染色； （3）Mayer蘇木素。,3、細胞形態(tài)： （1）凋亡細胞：體積縮小，胞漿濃縮、 紅染，核固縮深染或碎裂。 （2）凋亡小體（嗜酸性小體）：被巨噬細 胞或上皮細胞吞噬或游離的凋亡細胞。圓形 或卵圓形、大小不等，胞漿濃縮，強嗜酸性， 可有或無固縮深染的核碎片。,,,食管鱗癌細胞系TUNEL染色,食管鱗癌細胞系石蠟切片HE染色,（二）熒光顯微鏡下形態(tài)：熒光顯微鏡下凋亡細胞呈黃色。 1、 熒光染料： PI(propidium iodid

18、e) 510ug/ml DAPI（4，6diamidino-2-phenylindole） 12/ug/ml 7-AAD(7-aminoactinomycin D) 1020/ ug/ml,Hoechst 33342（12.3mg + 雙蒸10ml） /PI 雙染色。 2、染色時間：半小時1小時。 *PI染色因PI同時與RNA結(jié)合，應先用RNA酶消化（3715分鐘）,白血病細胞 HL-60 APO-BRDU,,鼻咽癌細胞Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡 400,（三）凋亡細胞的電鏡觀察： 1、組織處理：組織、細胞固定、包埋、 染色與一般電鏡標本相同。,（1）透射電鏡：與光鏡基

19、本相同，僅是放大倍數(shù)不同而已，表現(xiàn)如下：, 凋亡的細胞皺縮，胞膜完整, 胞漿致密，細胞器密集可有不同程度的退變（線粒體腫脹等）。, 核：染色質(zhì)致密，凝集成塊狀，邊集于核膜處胞核裂解。, 胞質(zhì)多發(fā)性芽突，芽突脫落凋亡小體（胞膜包繞，其中含有不同程度退變的細胞器和脂滴、核碎片可有可無）。,（2）掃描電鏡：細胞呈波浪狀或細胞表面結(jié)構(gòu)改變，如偽足，微絨毛消失等。,（四）凋亡細胞的原位末端轉(zhuǎn)移酶標記：（TdT-mediated dUTP nick end labeling ， TUNEL method）,原理：細胞凋亡細胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切 酶被激活核染色質(zhì)DNA雙鏈斷裂露 出3-OH末端DNA片段 TD

20、T酶與生物素 或地高辛標記的核苷酸結(jié)合熒光素/酶鏈 標記卵白素/抗地高辛抗體結(jié)合凋亡細胞 原位顯示。（檢測凋亡細胞的特異性手段）。,1、組織處理： （1）新鮮標本：人體組織離體后迅速固定，動物實驗可用內(nèi)灌注后處死。 （2）固定液：10%中性福爾馬林、4%多聚甲醛、80%乙醇。,（3）固定時間： 活組織不超過24小時，最好在4小時以內(nèi)。 冰凍切片4%多聚甲醛4固定30分鐘或80%乙醇固定2小時,（4）保存：石蠟塊 20保存，時間不超過半年。冰凍切片20保存，時間不超過一月。,2標記步驟：,試劑盒內(nèi)容： 標記緩沖液（Labeling Buffer）1ml 蛋白酶K(Proteinase

21、 K)100ul 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT,20）20ul DIG-dUTP(20) 20ul 封閉液（Blocking Reagent）2ml 生物素化抗地高辛抗體（100）20ul /堿性磷酸酶抗地高辛抗體 S-P試劑（100）20ul 自備：顯色液：DAB或BCIP/NBT。,Tunel法實驗操作步驟 1、二甲苯脫蠟，10分鐘3次； 2、 經(jīng)梯度酒精至蒸餾水； 3、0.85% NaCl、PBS各洗5分鐘； 4、4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)前固定15分鐘； 5、1PBS(PH7.4)洗 5分鐘3次,6、 蛋白酶K消化，室溫下12min 7、PBS洗 5分鐘1次 8、4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)后固定

22、5分鐘 9、PBS洗 5分鐘3次 10、 標記緩沖液室溫下10分鐘,11、TdT和Bio-dUTP混合液370C孵育70分鐘 12、 2SSC 洗 15分鐘 13、 PBS洗 5分鐘3次 14、 0.3% H2O2 5分鐘 15、 PBS洗 5分鐘3次,16、S-P 室溫30分鐘 17、PBS洗 5分鐘3次 18、DAB顯色30分鐘 19、蘇木素復染、酒精脫水、封片。,,Tunel染色法： 陽性部位定位于細胞核。,甲狀腺癌細胞核（+），TUNEL,肝組織 TUNEL ， AP反應,食管鱗癌角化珠凋亡細胞， TUNEL法。,食管鱗癌角化珠凋亡細胞， TUNEL法。,,鼻咽鱗癌細胞系TUNEL染色,腦星形細胞瘤 細胞核（+） TUNEL,干燥綜合征淚腺核（+），TUNEL,Tunel法染色注意事項： 1、切片脫蠟務必干凈； 2、蛋白酶K濃度及時間（新舊蠟塊不同）濃度20g/ml，時間5-15分鐘； 3、標記后洗脫液的濃度應注意(2SSC),4、TdT酶易失效，應在20保存； 5、TdT 酶和DIG-dUTP須臨時混合； 6、顯色時間鏡下控制可達30分鐘以上。,,（五）、凋亡檢測技術(shù)的應用： 1、某些疾病發(fā)生機理的研究； 2、腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的研究； 3、藥物療效的檢測。,The End,