基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,基因表達載體的構建,將目的基因導入受體細胞,目的基因的檢測與鑒定,（一）目的基因的提取,目的基因：主要是指_ 。 獲取方法： 1、_中獲取目的基因 2、 PCR反應擴增DNA 2、人工合成法：如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。,基本操作步驟,從基因文庫,編碼蛋白質的結構基因,從基因文庫中獲取目的基因,什么是基因文庫？ 什么是基因組文庫？ 什么是部分基因文庫？ 怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？ 目的基因的有關信息與什么相聯系？,1.從基因文庫中獲取目的基因,基因文庫： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,基因文庫,基因組文庫,部分基因文庫 （如cDNA文庫）,一種生物所有的基因,一種生物的一部分基因,基因文庫的構建過程,基因組文庫,目的基因的mRNA,單鏈DNA (cDNA）,雙鏈DNA (即目的基因),反轉錄,合成,1）反轉錄法： 以目的基因轉錄成的mRNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結構基因的核苷酸序列,目的基因,推測,推測,化學合成,2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,cDNA：,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),RNA聚合酶結合位點,外顯子,內含子,終止子,基因的結構,啟動子,原核,真核,一個典型的原核細胞基因結構示意圖,編碼區(qū):組成基因的核苷酸序列可以分為不同的區(qū)段,有的區(qū)段能夠轉錄為相應的信使RNA，進而指導蛋白質的合成，這樣的區(qū)段叫做編碼區(qū)。,非編碼區(qū)：有的區(qū)段不能轉錄為信使RNA，也就是說不能編碼蛋白質，這樣的區(qū)段叫做非編碼區(qū)。,一個典型的真核細胞基因結構示意圖,真核細胞基因結構的主要特點是： 編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。,能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子， 一般不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子。,2.PCR技術多聚酶鏈式反應（體外）,原理： 前提： 條件：,PCR擴增儀,DNA雙鏈復制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四種脫氧核苷酸（dNTP）,一對引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的兩條鏈為模板,溫度控制,方式：,以_形式擴增，即_（n為擴增循環(huán)的次數）,指數,2n,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合 延伸：加熱至7075以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈,需要提供合成模板； 合成的方向都是53。 DNA聚合酶不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3-OH；,1.目的基因DNA受熱變性，解鏈； 2.引物與單鏈互補結合； 3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。,利用PCR技術擴增目的基因,胞內DNA復制與PCR技術的比較：,高溫變性,Taq DNA聚合酶,DNA母鏈,dNTP,3個溫度,DNA或RNA,1.下表關于基因工程中有關基因操作 的名詞及對應的內容，正確的組合是,2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反轉錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細胞中提取 利用PCR技術 利用DNA轉錄 人工合成 A. B. C. D.,3、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTGTACAC，要使其數量增多，可用PCR技術進行人工復制，復制時應給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物 溫度變化 恒溫 A B C D,4、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數是 A.540個 B.8100個 C.17280個D.7560個,消耗的脫氧核苷酸數 設親代DNA分子中含有某種脫氧核苷酸數 m個，則： (1)經過n次復制，共需要消耗游離的該脫氧核苷酸數： (2)在第n次復制時，共需要消耗游離的該脫氧核苷酸數：,m (2n-1),m 2n-1,（二）基因表達載體的構建核心,質粒,DNA分子,一個切口 兩個黏性末端,兩個切口 獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質粒）,同一種 限制酶,目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。,（1）用一定的_切割質粒，使其出現一個切口，露出_。 （2）用_切斷目的基因，使其產生 _。,（3）將切下的目的基因片段插入質粒的_處，再加入適量_，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA連接酶,重組質粒形成過程:,科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。 然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。,資 料:,基因表達載體構建,基因表達載體的組成：,目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,啟動轉錄,是RNA聚合酶的識別和結合部位,位于基因的末端,終止轉錄,檢測目的基因是否導入受體細胞， 篩選出含目的基因的受體細胞,1、（多選）一個基因表達載體的構建應包括 A目的基因 B啟動子 C終止子 D標記基因,ABCD,2、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是 A啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼 B啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉錄起調控作用 C標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選 D基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別,A,3、目前轉基因工程可以 A. 打破地理隔離但不能突破生殖隔離 B. 打破生殖隔離但不能突破地理隔離 C. 完全突破地理隔離和生殖隔離 D. 部分突破地理隔離和生殖隔離,C,(三)將目的基因導入受體細胞,常用的受體細胞：,動植物細胞、大腸桿菌、土壤農桿菌、枯草桿菌等。,將目的基因導入受體細胞的原理：,借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。,轉化,目的基因進入_內，并且在 受體細胞內維持_和_的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,導入植物 細胞：,（三）將目的基因導入受體細胞,導入動物 細胞：,導入微生物細胞：,受體細胞 導入方法,體細胞 受精卵,受精卵,顯微注射法,Ca2處理法,1、將目的基因導入植物細胞,（1）農桿菌轉化法,特點:,能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力,Ti質粒的TDNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上,轉化過程:,Ti質粒 目的基因,構建,表達載體,植物細胞,植物細胞染色DNA,新性狀,農桿菌,（2）基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。,2、將目的基因導入動物細胞,方法:,顯微注射技術,操作程序:,提純含目的基因表達載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,受精卵發(fā)育,新性狀動物,3、將目的基因導入微生物細胞,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細胞原因： 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少,過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細胞,表達載體與感受態(tài)細胞混合,感受態(tài)細胞吸收DNA,增大細胞壁的通透性,1、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是 A結構簡單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質含量少、簡單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動植物細胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運載體結合 C.將目的基因導入受體細胞 D.目的基因的檢測和表達,C,4. 采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質粒重組，導入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng) A B C D,C,5. 下列屬于基因工程中導入目的基因方法的是 農桿菌轉化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,目的基因是否插入轉基 因生物染色體的DNA上,（四）目的基因的檢測與鑒定,目的基因是否表達：,目的基因是否轉錄：,鑒定,抗蟲性鑒定、抗病性鑒定、生物活性鑒定等（生理、性狀水平的檢測）,檢測,知識延伸DNA分子雜交技術,該方法是根據堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,基因工程概念解讀：,基因重組,體外,基因,DNA分子水平,剪切拼接導入表達,新的生物類型和生物產品,密碼子的通用性：生物界共用一套相同的密碼子,基本單位相同 結構相同堿基配對方式相同,安全性問題：生物安全、食品安全、環(huán)境安全,轉基因抗蟲棉,打破生殖隔離定向改造生物時間短,1、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是 A結構簡單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質含量少、簡單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動植物細胞 A B C D,B,D,2、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運載體結合 C.將目的基因導入受體細胞 D.目的基因的檢測和表達,C,3. 采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質粒重組，導入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng) A B C D,C,4. 下列屬于基因工程中導入目的基因方法的是 農桿菌轉化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,5、應用基因工程技術診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達到檢測疾病的目的。這里的基因探針是 A用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B用放射性同位素或熒光分子等標記的DNA分子 C合成-珠蛋白的DNA D合成苯丙羥化酶的DNA片段,6.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對目的基因是否導入進行檢測 C增加質粒分子的分子量 D便于與外源基因連接 7. 有關基因工程的敘述正確的是 A限制酶只在獲得目的基因時才用 B重組質粒的形成是在細胞內完成的 C質粒都可作為運載體 D蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料,8.哪項不是基因表達載體的組成部分( ) A.啟動子 B.終止密碼 C.標記基因 D.目的基因 9.下列哪項不是將目的基因導入植物細胞的方法( ) A基因槍法 B顯微注射法 C.農桿菌轉化法 D花粉管通道法,10）（多選）人們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產人類胰島素，這一過程涉及到（ ） A.用適當的酶對胰島素基因與運載體進行切割并連接 B.把重組后的DNA分子導入受體細菌內進行擴增 C.檢測重組DNA分子是否導入受體細菌內并表達出性狀 D.篩選出能產生胰島素的“工程菌”,ABCD,