微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 1 一、微生物的實驗室培養(yǎng) 1培養(yǎng)基 (1)培養(yǎng)基即人們按照 ， 配制出供其生長繁殖的基質(zhì)。 (2)按物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基劃分為 培養(yǎng)基和 培 養(yǎng)基 (如瓊脂培養(yǎng)基 )。 (3)培養(yǎng)基一般都含有的成分是： ， 在此基礎(chǔ)上還需滿足微生物生長對 的需求。 微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求 液體 固體 水、碳源、氮源和無機鹽 pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì) 及氧氣 2 2消毒和滅菌 項目 消毒 滅菌 條件 使用 的 理化方法 使用 的理化因素 結(jié)果 殺死物體表面或內(nèi)部 殺死物體內(nèi)外 較為溫和 強烈 一部分對人體有害的 微生物 (不包括芽孢和 孢子 ) 所有的 微生物，包括芽孢和 孢子 3 項目 消毒 滅菌 適用 實驗操作的空間、操作者 的衣著和手 培養(yǎng)器皿、接種用具和培 養(yǎng)基等 常用 方法 消毒法， 消 毒法，酒精、氯氣、石炭 酸等化學(xué)試劑消毒法 滅菌、 滅 菌、 滅菌 煮沸 巴氏 灼燒 干熱 高壓蒸汽 4 3大腸桿菌純化及菌種保藏 (1)制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的步驟為： 稱量 溶化 (2)微生物純化的原理及方法： 原理：在 培養(yǎng)基上將細菌稀釋或分散成 ， 使其長成單個的菌落，這個菌落就是一個純化的細菌菌落。 方法： ，要求無菌操作。 計算 滅菌 固體 單個細胞 倒平板 平板劃線法、稀釋涂布平板法 5 平板劃線法 倒平板 劃線 倒置培養(yǎng) 6 平板劃線接種法 7 稀釋涂布 平板法 8 稀釋 涂布 平板法 標(biāo)記濃度 取菌液 0.1mL 玻璃涂布器滅菌 涂布 培養(yǎng)、觀察 9 做一題 例 1 如下所示為培養(yǎng)某種微生物的培養(yǎng)基的配方，請 回答： 成分 含量 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO47H2O FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素 3 g 1 g 0 5 g 0 5 g 0 01 g 30 g 1 000 mL 0 1萬單位 10 (1)依物理狀態(tài)，該培養(yǎng)基屬于 _培養(yǎng)基；依用途 劃分，則屬于 _培養(yǎng)基。 (2)根據(jù)培養(yǎng)基的配方可判斷出，該培養(yǎng)基所培養(yǎng)微生物 的同化作用的類型是 _，培養(yǎng)的微生物可能 是 _。 (3)該培養(yǎng)基中的碳源是 _。不論何種培養(yǎng)基，在 各成分都溶化后分裝前，要進行的是 _和 _；倒平板時，一般需冷卻至 _左右， 并且要在 _附近操作。 11 (4)若用該培養(yǎng)液培養(yǎng)纖維素分解菌，應(yīng)除去的物質(zhì)是 _，至少應(yīng)加入的物質(zhì)是 _，為檢測 纖維素分解菌的存在與否還應(yīng)加入 _，形成 _色復(fù)合物，若產(chǎn)生 _，則證明有纖 維素分解菌存在。 12 解析 (1)從培養(yǎng)基成分看，沒有瓊脂等凝固劑，屬于液 體培養(yǎng)基；從用途上分析，加入青霉素可以殺死細菌、放 線菌，選擇出霉菌、酵母菌等屬于選擇培養(yǎng)基。 (2)該生物 以培養(yǎng)基中的 (CH2O)作碳源，為異養(yǎng)型微生物。 (3)考查微 生物培養(yǎng)的基本操作。 (4)培養(yǎng)纖維素分解菌，是以纖維素 作碳源，故應(yīng)去除 (CH2O)；培養(yǎng)細菌應(yīng)去除能殺滅細菌的 青霉素?？捎脛偣t與纖維素形成紅色復(fù)合物，檢測纖維 素分解菌的存在。若存在，菌落周圍會形成透明圈。 13 答案 (1)液體 選擇 (2)異養(yǎng)型 酵母菌或霉菌 (3)(CH2O) 調(diào)整 pH 滅菌 50 酒精燈火焰 (4)青霉素和 (CH2O) 瓊脂和纖維素粉 剛果紅 紅 透明圈 14 鏈一串 1微生物的營養(yǎng) 營養(yǎng) 要素 含義 作用 主要來源 碳源 凡能提供所需 碳元素的物質(zhì) 構(gòu)成生物體細胞 的物質(zhì)和一些代 謝產(chǎn)物，有些是 異養(yǎng)生物的能源 物質(zhì) 無機化合物： CO2、 NaHCO3； 有機化合物：糖類、 脂肪酸、花生餅粉、 石油等 15 營養(yǎng) 要素 含義 作用 主要來源 氮源 凡能提供 所需氮元 素的物質(zhì) 合成蛋白質(zhì)、核 酸以及含氮的代 謝產(chǎn)物 無機化合物： N2、 NH3、銨鹽、硝酸鹽； 有機物化合物：尿素、 牛肉膏、蛋白胨等 16 營養(yǎng) 要素 含義 作用 主要來源 生長 因子 生長必不可少的 微量有機物 酶和核酸的組成 成分 維生素、氨基酸、 堿基等 水和無 機鹽 水不僅是優(yōu)良溶劑，而且可維持 生物大分子的穩(wěn)定；無機鹽是細 胞內(nèi)成分和調(diào)節(jié)物質(zhì) 外界攝入 17 關(guān)鍵一點 微生物之所以需要補充生長因子，是由 于其體內(nèi)缺乏合成這些物質(zhì)所需要的酶或合成能力 有限，而對那些合成能力足以滿足自身需求的微生 物，其培養(yǎng)基中則不需額外補充生長因子。 18 2培養(yǎng)基的類型 劃分 標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng) 基種類 特點 用途 狀態(tài) 液體 培養(yǎng)基 不加凝固劑 工業(yè)生產(chǎn) 固體 培養(yǎng)基 加凝固劑， 如瓊脂 微生物分離、鑒 定等 19 劃分 標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng) 基種類 特點 用途 用 途 選擇 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中加入某種 化學(xué)物質(zhì)，用來抑 制不需要的微生物 的生長，促進所需 要的微生物的生長 培養(yǎng)和分離出特定 微生物 (如分離酵 母菌和霉菌，可以 在培養(yǎng)基中加入青 霉素 ) 20 劃分 標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng) 基種類 特點 用途 用 途 鑒別 培養(yǎng)基 根據(jù)微生物的 代謝特點，在 培養(yǎng)基中加入 某種指示劑或 化學(xué)藥品 鑒別不同種類的微生物， 如用伊紅 美藍培養(yǎng)基鑒 別飲用水或乳制品中是否 含有大腸桿菌 (若有，則 菌落呈深紫色并帶有金屬 光澤 ) 21 3平板劃線法的注意事項 (1)第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒接種環(huán)進行滅菌， 劃線操作結(jié)束仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒目的如下表： 22 第一次灼燒 每次劃線之前灼燒 劃線結(jié)束后灼燒 目的 避免接種環(huán)上 可能存在的微 生物污染培養(yǎng) 物 殺死上次劃線結(jié)束后 接種環(huán)上殘留的菌種， 保證每次劃線的菌種 都來自上次劃線的末 端 殺死接種環(huán)上殘 留的菌種，避免 細菌污染環(huán)境和 感染操作者 23 (2)灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后才能伸入菌液，以免因溫度 太高殺死菌種。 (3)劃線時最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連。 (4)劃線用力要大小適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。 24 通一類 1右圖是微生物平板劃線示意圖。 劃線的順序為 12345。下列操作 方法正確的是 ( ) A只需操作前將接種環(huán)放在火焰旁灼燒滅菌即可 B劃線操作需在火焰上進行 C在 5區(qū)域中才可以得到所需菌落 D在 12345區(qū)域中畫線前后都要對接種環(huán)滅菌 25 解析： 操作的前后都要對接種環(huán)進行滅菌。劃線操作需 在火焰旁進行，而不是在火焰上；所有的劃線區(qū)都有可 能得到所需菌落，只是 5區(qū)得到的菌落相對較純。 答案： D 26 考點二 目標(biāo)微生物的篩選與培養(yǎng) 考情 解讀 目標(biāo)微生物的篩選是微生物應(yīng)用的前提，相 關(guān)技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物實驗室培養(yǎng)及發(fā)酵工業(yè)生 產(chǎn)實踐中，本考點也常作為熱點內(nèi)容呈現(xiàn)在各地高 考試卷中，考查點著重于選擇培養(yǎng)基的制備、目標(biāo) 微生物的分離流程、對照實驗的設(shè)置等， 2014年 備考應(yīng)格外關(guān)注。 27 做一題 例 2 從自然菌樣篩選較理想生產(chǎn)菌種的一般步驟是：采集 菌樣 富集培養(yǎng) 純種分離 性能測定。 (1)不同微生物的生存環(huán)境不同，獲得理想微生物的第一步是 從合適的環(huán)境中采集菌樣，然后再按一定的方法分離、純 化。培養(yǎng)嗜鹽菌的菌樣應(yīng)從 _ 環(huán)境中采集。 (2)富集培養(yǎng)指創(chuàng)設(shè)僅適合待分離微生物旺盛生長的特定環(huán)境 條件，使其數(shù)量大大增加，從而分離出所需微生物的培養(yǎng) 方法。對產(chǎn)耐高溫淀粉酶微生物的富集培養(yǎng)應(yīng)選擇 _ 的培養(yǎng)基，并在 _ 條件下培養(yǎng)。 28 (3)下面兩圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后 培養(yǎng)的效果圖解，請分析接種的具體方法。 獲得圖 A效果的接種方法是 _ ，獲得圖 B效果 的接種方法是 _ 。 (4)配制培養(yǎng)基時各種成分在溶化后分裝前必須進行 _，接種前要進行 _ ，在整個微生物的分 離和培養(yǎng)中，一定要注意在 _ 條件下進行。 29 解析 (1)嗜鹽菌就生活在高鹽環(huán)境中，如海灘等環(huán)境。 (2)耐高溫淀粉酶應(yīng)存在于以淀粉為唯一碳源且在高溫環(huán) 境中生存的微生物體內(nèi)。 (3)從菌落分布的特點可以看出， A純化微生物的接種方法是稀釋涂布平板法， B純化微生 物的接種方法是平板劃線法。 (4)培養(yǎng)基配制時應(yīng)先溶化， 再調(diào)整 pH值，然后滅菌。 答案 (1)海灘等高鹽 (2)以淀粉為唯一碳源 高溫 (3)稀釋涂布平板法 平板劃線法 (4)pH調(diào)整 高壓蒸汽滅菌 無菌 30 鏈一串 1幾種典型微生物的篩選方法 (1)培養(yǎng)基中加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。 (2)培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。 (3)培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可以分離固氮微生物，因為非 固氮微生物不能在此培養(yǎng)基上生存。 31 (4)當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時，也具有 分離效果。如當(dāng)石油是唯一碳源時，可以抑制不能利 用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生 存，達到分離能消除石油污染的微生物的目的。 (5)改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達到分離微生物的目 的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫 的微生物。 32 2微生物篩選過程中必要的兩種對照培養(yǎng)基及其作用 對照組 作用 現(xiàn)象 結(jié)論 未接種 培養(yǎng)基 有無雜菌污 染的判斷 未接種的培養(yǎng)皿中無 菌落生長 未被雜 菌污染 接種的 牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 篩選作用的 確認 牛肉膏培養(yǎng)基上的菌 落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基 上的數(shù)目 選擇培 養(yǎng)基具 有篩選 作用 33 關(guān)鍵一點 即使使用了選擇培養(yǎng)基，所得到的微生物也 未必全為 “目標(biāo)微生物 ”，因此，常需對選擇培養(yǎng)基中菌落 作進一步鑒定。 34 通一類 2下表為培養(yǎng)某種微生物的培養(yǎng)基配方，下列相關(guān)敘述 錯誤的是 ( ) 成分 NaN O3 K2H PO4 KCl MgS O47 H2O FeS O4 (CH2 O) H2O 青霉 素 含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g 0.0 1 g 30 g 1 000 mL 0.1 萬單 位 35 A依物理性質(zhì)劃分，該培養(yǎng)基屬于液體培養(yǎng)基 B依用途劃分，該培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基 C培養(yǎng)基中的唯一碳源是 (CH2O)，唯 一氮源是 NaNO3 D若用該培養(yǎng)基培養(yǎng)纖維素分解菌，則應(yīng)除去 (CH2O)， 再添加纖維素 36 解析： 由于配方中沒有瓊脂，所以從物理性質(zhì)上劃分為 液體培養(yǎng)基；由于配方中含有青霉素，對微生物有一定 的篩選作用，所以從用途上劃分為選擇培養(yǎng)基；由于培 養(yǎng)基中含有青霉素，纖維素分解菌不能生存，除去 (CH2O)外，還應(yīng)除去青霉素，同時添加纖維素和瓊脂。 答案： D 37 3苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在 著能降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯 酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選 獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主要步 驟如下圖所示，為土壤樣品。下列相關(guān)敘述錯誤的 是 ( ) 38 A圖中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應(yīng)加入苯酚作為 碳源 B如果要測定中活細菌數(shù)量，常采用稀釋涂布平板法 C若圖中為對照實驗，則其中應(yīng)以苯酚作為唯一的碳 源 D使用平板劃線法可以在上獲得單菌落 39 解析： 用苯酚作為選擇培養(yǎng)基的特殊碳源，目的菌能夠 存活，而其他菌因沒有可利用的碳源而不能生長。測定 培養(yǎng)液中細菌數(shù)目多使用稀釋涂布平板法。若為對照 實驗，則應(yīng)含除苯酚外的其他碳源，以苯酚作為唯 一碳源。使用稀釋涂布平板法或平板劃線法都可以在 上獲得單菌落。 答案： C 40 考點三 微生物的數(shù)量測定 考情 解讀 本考點內(nèi)容在生物技術(shù)實踐中占有比較重要的 地位，有關(guān)特定微生物的數(shù)量測定廣泛應(yīng)用于食品 及水質(zhì)檢測等實踐中，具重要的應(yīng)用價值，近年高 考常將微生物計數(shù)與微生物培養(yǎng)及篩選綜合命題， 故 2013年備考仍需重點關(guān)注。 41 做一題 例 3 急性腸胃炎、手足口病分別是由細菌和病毒通過消化 道進入人體導(dǎo)致的。因此檢驗飲用水的細菌含量和病毒含量 是有效監(jiān)控疾病發(fā)生的必要措施，請回答下列與檢驗飲用水 有關(guān)的問題： (1)檢驗大腸桿菌的含量時，通常將水樣進行一系列的梯度稀 釋，然后將不同稀釋度的水樣用涂布器分別涂布到瓊脂固 體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)量，這種方法稱為 _。在下面所示的四種菌 落分布圖中，不可能是用該方法得到的是 _。 42 (2)用該方法統(tǒng)計樣本菌落數(shù)時是否需要設(shè)置對照組？ _。為什么？ _。 (3)如分別取 0.1 mL已稀釋 103倍的水樣分別涂布到三個瓊脂 固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基記錄到大腸桿菌的 菌 落數(shù)分別為 55、 56、 57，則每升原水樣中大腸桿菌數(shù)為 _。 43 (4)已知大腸桿菌能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，現(xiàn)提供足量的 已滅菌的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和具塞試管，應(yīng)如何判斷 待檢水樣中是否含有大腸桿菌？ _ _。 44 解析 純化大腸桿菌的方法 稀釋涂布平板法和平板 劃線法。刪除偏差太大的數(shù)據(jù)，對剩下的多個培養(yǎng)數(shù)據(jù) 進行平均處理就可以得到水樣中的大腸桿菌數(shù)。大腸桿 菌能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，通過密封培養(yǎng)，大腸桿菌可 以進行無氧呼吸產(chǎn)生氣體，以氣泡的形式釋放出來。 45 答案 (1)稀釋涂布平板法 D (2)需要 因為需要判 斷培養(yǎng)基是否被雜菌污染 (培養(yǎng)基滅菌是否合格 ) (3)5.6 108 (4)通過無菌操作向試管內(nèi)注入一定量待檢 水樣，再注入已滅菌的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液將試管充滿， 塞上塞子，混勻后置于 37 恒溫箱培養(yǎng) 24 h。若試管內(nèi)有 氣泡生成，則說明水樣中有大腸桿菌 46 鏈一串 微生物的數(shù)量測定 1實驗流程 土壤取樣：從距地表約 3 8 c m 的土壤層中取樣 樣品的 稀釋 測細菌數(shù)：選用 10 4 、 10 5 、 10 6 倍稀釋 測放線菌數(shù)：選用 10 3 、 10 4 、 10 5 倍稀釋 測真菌數(shù)：選用 10 2 、 10 3 、 10 4 倍稀釋 47 微生物的培 養(yǎng)與觀察 細菌：在 30 37 下培養(yǎng) 1 2 d 放線菌：在 25 28 下培養(yǎng) 5 7 d 霉菌：在 25 28 下培養(yǎng) 3 4 d 48 2統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法 (1)顯微鏡直接計數(shù)法： 原理：利用特定細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯 微鏡下計算一定容積的樣品中微生物數(shù)量。 方法：用計數(shù)板計數(shù)。 缺點：不能區(qū)分死菌與活菌。 49 (2) 間接計數(shù)法 (活菌計數(shù)法 )： 原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一 個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。 通過統(tǒng)計平板 上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 操作：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 30 300 的平板進行計數(shù)。 計算公式：每克樣品中的菌株數(shù) (C V) M，其中 C 代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)， V代表涂布 平板時所用的稀釋液的體積 (mL)， M代表稀釋倍數(shù)。 50 3操作提示 (1)將待測樣品經(jīng)一系列 10倍梯度稀釋，然后選擇 3個稀 釋度的菌液，分別取 0.1 mL接種到已制備好的平板 上，然后用無菌涂布器將菌液涂布在整個平板表面， 放在適宜的溫度下培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)。 (2)為使結(jié)果接近真實值，可將同一稀釋度菌液加到 3個 或 3個以上的平板上，經(jīng)涂布、培養(yǎng)，計算出菌落平 均數(shù)。 51 關(guān)鍵一點 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。這 是因為當(dāng)兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的 只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果用菌落數(shù)而不是活菌數(shù) 來表示。 52 通一類 4通過實驗測定土壤中的細菌數(shù)量，下列與此操作有 關(guān)的敘述中，不正確的是 ( ) A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、 高壓滅菌后倒平板 B取稀釋倍數(shù)分別為 104、 105和 106倍的土壤稀釋 液各 0.1 mL，分別涂布于各組平板上 C將培養(yǎng)皿倒置， 37 恒溫培養(yǎng) 12 24小時 D選擇菌落數(shù)在 300個以上的培養(yǎng)皿進行計數(shù) . 53 解析： 檢測土壤中細菌總數(shù)，用蒸餾水配制牛肉膏蛋白 胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板，取 104、 105、 106倍的土壤稀釋液各 0.1 mL，分別涂布于各組平板上， 將平板倒置， 37 恒溫培養(yǎng) 24 48小時，選擇菌落數(shù)在 30 300的平板進行計數(shù)。 答案： D 54 5在做分離分解尿素的細菌實驗時，某同學(xué)從對應(yīng) 106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約 150個菌落，而其他同 學(xué)只選擇出大約 50個菌落。某同學(xué)的結(jié)果產(chǎn)生原因 可能有 ( ) 土樣不同 培養(yǎng)基污染 操作失誤 沒有 設(shè)置對照 A B C D 55 解析： 某同學(xué)比其他同學(xué)的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)大許多，可能 由于選取的土樣不同、培養(yǎng)基滅菌不徹底或操作過程中 雜菌污染，也可能是操作失誤，如配制的培養(yǎng)基中混入 其他含氮物質(zhì)等。 答案： A 56